Метаболические критерии дисбактериоза кишечника при острых кишечных инфекциях у детей

Одним из факторов, определяющих тяжесть острой кишечной инфекции (ОКИ), ее продолжительность, исход и сроки санации от возбудителя, является состояние микробиоценоза кишечника. Роль нормальной микрофлоры кишечника при ОКИ заключается в поддержании механизмов естественной резистентности за счет конкуренции с патогенами за рецепторы слизистой оболочки кишечника на стадии их первичной адгезии и колонизации. Под влиянием эуфлоры происходит активация системы комплемента и фагоцитоза, усиление выработки IgM и секреторного IgА, что играет важную роль в санации организма от возбудителей ОКИ [1].
   В норме под действием анаэробной индигенной (сахаролитической) микрофлоры кишечника в процессе ферментации углеводов и различных нутриентов образуется целый ряд низкомолекулярных метаболитов - летучих жирных кислот (ЛЖК), выполняющих в организме ряд важных функций, включая стимуляцию жизнедеятельности нормальной микрофлоры.
   ЛЖК - монокарбоновые кислоты с длиной цепи до 8 атомов углерода, в англоязычной литературе их еще называют "short certain fatty acids" (SCFA) - короткоцепочечными жирными кислотами. К ним относят уксусную (С2), пропионовую (С3), масляную (С4), изомасляную (iC4), валериановую (С5), изовалериановую (iC5), капроновую (С6), изокапроновую (iC6) кислоты. Неразветвленные ЛЖК - уксусная, пропионовая и масляная - образуются при анаэробном брожении углеводов, тогда как метаболизация белков ведет к образованию разветвленных кислот: изомасляной (из валина) и изовалериановой (из лейцина) [2]. Основным углеводным субстратом, доступным микрофлоре, служат непереваренные остатки оболочек растительных клеток, обычно называемые пищевыми волокнами. Источником других углеводов, потенциально способных метаболизироваться микрофлорой, служит слизь.
   В табл. 1 приведена характеристика ЛЖК.
   На роль ЛЖК как основных анионов в просвете кишечника указывалось еще в прошлом столетии. Затем ими занимались преимущественно ветеринары, исследуя роль ЛЖК в пищеварении жвачных животных [2]. К настоящему времени накоплено много фактов, свидетельствующих об участии и регулирующей роли ЛЖК в большинстве физиологических эффектов, оказываемых индигенной микрофлорой в организме.
   ЛЖК участвуют в поддержании водно-электролитного баланса в просвете кишки. Вместе с ЛЖК всасываются ионы натрия, калия, хлора и воды. От всасывания ЛЖК зависит содержание карбонатов в просвете кишки и рН кишечного содержимого. У жвачных животных они обеспечивают почти 70% энергопотребности организма. У человека вклад ЛЖК в энергобаланс точно не установлен, однако предполагается, что он составляет не менее 20-25% ежедневной потребности. Особенно велика роль уксусной, масляной и капроновой кислот.
   ЛЖК, особенно масляная кислота, является основным источником питания колоноцитов, обеспечивая их энергией почти на 70%. Они стимулируют пролиферацию кишечного эпителия. Предполагают большую значимость бутирата (масляной кислоты) как источника энергии в дистальном отделе толстой кишки.
   ЛЖК обладают антибактериальной активностью. Благодаря этому они могут служить важным фактором в поддержании баланса микробной экосистемы. Они могут как препятствовать колонизации кишечника патогенными микроорганизмами (например, шигеллами и сальмонеллами), так и служить промоторами роста некоторых анаэробных бактерий.
   Многочисленные исследования показали защитную роль масляной кислоты в отношении появления и роста раковой опухоли толстой кишки.
   У ЛЖК обнаружено еще много других эффектов, таких как поддержание детоксикационной функции печени, участие в энергогепатической циркуляции желчных кислот, участие в регуляции моторики гладкой мускулатуры кишечника и мезентериальных сосудов, влияние на экспрессию различных генов в колоноцитах, влияние на уровень некоторых гормонов гипофиза, антиканцерогенное, противовирусное действие (в частности, подавление репликации вирусов герпеса и цитомегаловируса).
   В последние годы проведено большое количество исследований, показывающих, что ЛЖК - реально активные модуляторы деятельности иммунной системы [2].
   Доказано, что все эффекты нормальной и изоформ ЛЖК концентрационно зависимы и их гиперпродукция, так же как и недостаток, может оказывать отрицательное воздействие на организм.
   Следовательно, ЛЖК в зависимости от ситуации способны играть как физиологическую, так и патофизиологическую роль в организме.
   При различных заболеваниях и патофизиологических состояниях желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в том числе и при ОКИ, процесс образования, всасывания и утилизации ЛЖК нарушается, поэтому концентрации и особенно соотношения отдельных ЛЖК в фекалиях меняются. Следовательно, разнонаправленные отклонения от физиологической нормы уровней и спектров этих метаболитов могут служить биохимическими маркерами структурных и функциональных нарушений кишечного микробиоценоза. Информация об интегральном количестве ЛЖК может иметь диагностическое и прогностическое значение.
   Для оценки метаболической активности кишечной микрофлоры помимо абсолютных концентраций отдельных ЛЖК используется такой показатель, как их суммарная концентрация - общий уровень метаболитов (ОУМ), отображающий метаболическую активность как просветных, так и пристеночных популяций. При этом низкий общий уровень метаболитов свидетельствует о понижении метаболической активности нормальной микрофлоры, возможном снижении моторики толстой кишки, а также о дефиците пищевых субстратов. Повышение общего уровня метаболитов может отмечаться в случае гиперколонизации толстой кишки отдельными представителями анаэробной микрофлоры, усилении ее метаболической активности, при ферментативной недостаточности, нарушении всасывания.
   Анаэробный индекс (АИ) рассматривается как отношение концентраций всех ЛЖК, кроме уксусной, к концентрации уксусной кислоты. Определение АИ позволяет судить об инфраструктуре микробиоценоза, степени анаэробиоза (отношении строгих анаэробов к аэробам и факультативно анаэробным популяциям). Его повышение свидетельствует об угнетении популяций строго анаэробной микрофлоры [3].
   Современные приемы микробиологического исследования, общепринятый анализ на дисбактериоз позволяют выявить лишь те или иные отклонения в количественном составе некоторых популяций микрофлоры, оставляя неучтенными пристеночные, более значимые в функциональном плане популяции микрофлоры. Классический микробиологический метод диагностики состояния и нарушения микробиоценоза - достаточно трудоемкий, дорогостоящий и длительный (не менее 7 дней) лабораторный анализ. Являясь количественным методом, он не позволяет оценить метаболическую активность анаэробной микрофлоры и тем самым не дает возможности оценивать взаимосвязанные микроэкологические и функциональные нарушения пищеварительного тракта.
   Поэтому в последние годы приобрели большую актуальность поиски экспрессных методов диагностики, позволяющих в короткие сроки достоверно оценить состояние кишечной микрофлоры путем исследования биохимической активности соответствующих групп микроорганизмов.
   Одним из таких перспективных направлений изучения микроэкологии кишечника в норме и при патологии является метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ), основанный на определении метаболической активности микрофлоры по спектрам и уровням ЛЖК. Этот метод позволяет в режиме реального времени (30-40 мин) выявить интегральную метаболическую активность микрофлоры кишечника, структурный и метаболический дисбаланс анаэробных популяций микрофлоры, а также суммарное количество бактериальных метаболитов, способных оказывать как физиологические, так и патофизиологические эффекты в организме. Последнее имеет и диагностическое, и прогностическое значение, особенно у детей [3].
   При ОКИ возникают реальные условия для микроэкологических нарушений, поэтому особенно актуальной является количественная и качественная оценка состава микрофлоры, необходимая для выбора оптимальной тактики лечения.
   В силу незрелости ферментативных и барьерных систем у детей, особенно у детей раннего возраста, не только образование, но и метаболизация, и усвоение продуктов жизнедеятельности нормальной микрофлоры несовершенны. Вследствие этого у детей в раннем возрасте подверженность слизистых оболочек колонизации условнопатогенной флорой особенно выражена. Помимо прочего, в детском возрасте более очевидна взаимосвязь функциональных и микроэкологических нарушений, поэтому дополнительное использование копрологического анализа с известным набором признаков (физические параметры, степень гидролиза поступающих в толстую кишку нутриентов, желчеотделение, всасывательная способность слизистых оболочек, скорость транзита и др.) дает более полное представление о процессах микробного пищеварения в толстой кишке.   

Материал и методы
   Проводилось изучение метаболизма кишечной микрофлоры у детей младшего возраста при ОКИ по количественному содержанию и спектрам ЛЖК методом ГЖХ в комплексе с микробиологическим и копрологическим исследованием. Выборочно обследованы 60 детей от 1 года до 3 лет с легким и среднетяжелым течением заболевания, госпитализированных в инфекционные отделения Тушинской ДГБ (главный врач В.Ф.Смирнов). В основу деления на группы положена этиопатогенетическая классификация ОКИ по типам диареи [4]. Осмотический тип диареи, ассоциированный с ротавирусом, был установлен у 30 (50%) детей, составивших 1-ю группу, инвазивный тип - у 28 (46,7%) детей и секреторный - у 2 (3,3%) детей. Случаи инвазивных и секреторных диарей (30 детей) были объединены во 2-ю группу бактериальных ОКИ для удобства сравнения. Все дети в обеих группах были сопоставимы для статистической обработки данных по возрасту (1-3 года), тяжести (легкие и среднетяжелые формы) и срокам исследования (1-2-й день болезни, 1-е сутки госпитализации). Из исследования были исключены больные, получавшие на догоспитальном этапе этиотропную терапию.
   Всем детям исследуемой группы в 1-2-е сутки пребывания в стационаре проводили комплекс лабораторной диагностики, включающий общеклинические анализы, бактериологическое исследование кала на наличие патогенных энтеробактерий, определение антигена ротавирусов в фекалиях методом иммуноферментного анализа (ИФА) в условиях клинической и бактериологической лаборатории стационара. Одновременно производили забор проб фекалий в стерильную пластиковую и стеклянную посуду для проведения комплексного анализа кала, включающего микробиологическое, копрологическое исследование по стандартным методикам и определение уровней ЛЖК методом ГЖХ.   

Результаты и обсуждение
   Полученные в ходе анализа данные свидетельствуют о том, что при всех ОКИ вне зависимости от этиологии имеет место угнетение и снижение метаболической активности нормальной микрофлоры, что выражается снижением уровня как отдельных ЛЖК, так и их суммарного общего уровня.
   В табл. 2 представлены абсолютные концентрации отдельных ЛЖК в группах вирусных и бактериальных диарей относительно диапазона норм этих показателей для детей от 1 года до 3 лет.
   Так, концентрации уксусной кислоты (С2) при всех ОКИ были снижены, не достигая ни у одного ребенка нижней границы нормы. Однако более низкие показатели уксусной кислоты отмечены в группе бактериальных диарей [Ме=2,1976 мг/мл (1,3734:2,7404) против Ме=2,6886 мг/мл (2,1616:3,0763) в группе вирусных ОКИ], что объясняется более выраженным угнетением продуцентов этого метаболита (большинство анаэробных популяций E. coli), за счет инвазии и развития воспалительного процесса в слизистой оболочке толстой кишки.
   Особенно выраженные и статистически достоверные (p=0,02) различия между группами получены в показателях масляной кислоты (С4). При этом концентрация С4 у большинства детей в группе вирусных диарей практически не отличалась от нормы [Ме=0,6648 мг/мл (0,4634:1,0428)], а при бактериальных ОКИ была в 2-3 раза ниже [Ме=0,2438 мг/мл (0,0787:0,4621)]. Данный метаболит, как известно, является энергосубстратом для эпителиоцитов толстой кишки, и его показатели характеризуют состояние слизистой оболочки.
   Показатели концентраций пропионовой кислоты (С3), продуцентами которой являются Veilonella, Propionobacterium, Bacteroides, Fusobacterium, у большинства детей обеих групп были снижены или имели тенденцию к снижению относительно нормы [Ме=0,5647 мг/мл (0,3597:0,8878) - в группе вирусных ОКИ и Ме=0,4258 мг/мл (0,2476:0,9906) - в группе бактериальных, при норме для детей этого возраста - от 0,8408 до 1,108 мг/мл]. При этом межгрупповые различия в концентрациях С3 были недостоверными (p>0,05).
   Показатели валериановой кислоты (С5), продуцируемой клостридиями, пептококками и пептострептококками, были ниже возрастной нормы у 87% детей в группе бактериальных диарей и у лишь у 7% детей в группе вирусных. При этом концентрация С5 при бактериальных ОКИ была более чем в 2 раза ниже таковой при вирусных [Ме=0,0243 мг/мл (0,0125:0,0683) против Ме=0,0497 мг/мл (0,0270:0,1127) соответственно], что является статистически достоверным (p=0,042) и свидетельствует об угнетении продуцентов этого метаболита, а также о дефиците сбраживаемых ими субстратов.
   Концентрации изокислот: изомасляной (iC4) и изовалериановой (iC5) как конечных продуктов микробной ферментации у большинства детей с бактериальными диареями - были снижены относительно нормы, а в группе вирусных ОКИ от нормы практически не отличались. Межгрупповые различия в концентрациях изокислот были статистически недостоверными (p>0,05). Капроновая (С6) и изокапроновая кислоты (iC6) ни в одном случае обнаружены не были.

   Исходя из концентраций отдельных кислот, определялась их суммарная концентрация - общий уровень метаболитов (ОУ), который у всех детей был ниже возрастной нормы (рис. 1, а). Однако в группе бактериальных ОКИ он был на 20-30% ниже, чем в группе вирусных [Ме=3,33 мг/мл (1,95:4,58) против Ме=4,28 мг/мл (3,54:5,64) соответственно], что можно объяснить селективным угнетением нормальной микрофлоры, в особенности анаэробных популяций приэпителиальной зоны, патогенной бактериальной флорой с инвазивными свойствами.
   Уровень АИ (рис. 1, б) был подвержен значительным колебаниям в группе вирусных диарей (Ме=0,65 [0,35:0,97]) в большей степени, чем при бактериальных ОКИ, превышая возрастную норму, отражая тем самым угнетение в основном продуцентов уксусной кислоты (E. coli и анаэробных популяций). При ОКИ бактериальной этиологии АИ был ближе к возрастной норме [Ме=0,56 (0,39:0,71)], что объясняется одновременным угнетением продуцентов всех ЛЖК, т.е. структурным и метаболическим дисбалансом внутри популяций.
   Для бактериальных ОКИ были характерны более высокие значения индекса изокислот (ИИ), который отображает отношение суммы изомасляной и изовалериановой кислот к сумме нормальных масляной и валериановой кислот (рис. 1, в), что свидетельствует, во-первых, о повышенной ферментации гликопротеидов слизистой оболочки в условиях дефицита субстрата сбраживания из-за угнетения нормальной микрофлоры, а во-вторых, о снижении утилизации изокислот в условиях патологического состояния слизистой оболочки. При этом межгрупповые различия в показателях ИИ [Ме=0,46 (0,33:0,68) - в группе бактериальных ОКИ и Ме=0,18 (0,14:0,39)] - в группе вирусных) были достоверными (p=0,021).
   Анализ копрологических показателей в исследуемых группах (рис. 2) позволяет отметить наличие более выраженных функциональных нарушений верхних отделов ЖКТ у детей с вирусными ОКИ, у которых в 2 раза чаще, чем у детей с бактериальными диареями (52% против 26%), обнаруживался нейтральный жир в большом количестве, почти в 5 раз чаще (19% против 4%) - жирные кислоты в большом количестве и в 3 раза чаще (22% против 7%) - соли жирных кислот. Данные нарушения объясняются ферментативной недостаточностью как одним из звеньев патогенеза диарей осмотического типа, характерных для всех вирусных ОКИ.
   В группе бактериальных диарей отмечена тенденция к росту частоты обнаружения в кале воспалительного белка (у 59% детей этой группы против 41% детей группы вирусных ОКИ).
   По данным микробиологического анализа, выраженные изменения в количественном составе микрофлоры отсутствовали. Количество бифидобактерий у большинства детей обеих групп оставалось на уровне 107-109 КОЕ/мл. Условно-патогенная флора в обеих исследуемых группах определялась практически с одинаковой частотой, за исключением стафилококка, который при бактериальных ОКИ выявлялся почти в 4 раза чаще, чем при вирусных (15% против 4% соответственно).
   В качестве демонстрации типичных изменений хроматограмм и копрограмм, характерных для ОКИ различной этиологии, на рис. 3, 4 приводим результаты биохимического анализа микрофлоры двух пациентов: с ротавирусным гастроэнтеритом (пациент К., 2 года) и шигеллезом Флекснера (пациент Л., 1 год 5 мес).
   Таким образом, данные анализа микробиологических исследований свидетельствуют лишь о количественных изменениях в составе нормальной и условно-патогенной микрофлоры и не позволяют судить о функциональном состоянии и метаболической активности микрофлоры при ОКИ различной этиологии. Быстро и комплексно оценить структурные и функциональные нарушения внутри популяций микрофлоры (особенно обитающих в приэпителиальной зоне), состояние слизистой оболочки помогает проведение в режиме реального времени биохимического анализа кала. Дополняет данные этого исследования копрологический анализ, позволяющий оценить в первую очередь функциональное состояние верхних отделов ЖКТ, нарушение которых часто является одной из причин микробного дисбаланса.
   Полученные в ходе комплексной оценки микрофлоры с использованием ГЖХ данные коррелируют с патогенетически обусловленными особенностями клинической картины вирусных и бактериальных кишечных инфекций. Так, при бактериальных ОКИ вследствие инвазии возбудителя возникает воспалительный процесс в слизистой оболочке толстой кишки с угнетением метаболической активности большинства микроорганизмов - продуцентов ЛЖК (особенно обитающих в приэпителиальной зоне), в результате чего отмечается снижение как общего уровня, так и отдельных концентраций ЛЖК (в первую очередь масляной кислоты, сниженной более чем в 3 раза). Клинически это проявляется развитием диареи инвазивного типа с патологическим характером стула (слизь, зелень, кровь), сопровождающейся в большинстве случаев выраженными симптомами интоксикации, абдоминальным синдромом и иногда - рвотой. В отличие от бактериальных при вирусных ОКИ патологический процесс захватывает верхние отделы ЖКТ и тонкую кишку с развитием ферментопатии (дисахаридазная недостаточность) и дисхолии, отражением чего являются изменения в копрограмме. Метаболические нарушения кишечной микрофлоры при этом возникают вследствие ускоренного транзита содержимого и изменения состава сбраживаемых субстратов без развития воспаления в слизистой оболочке толстой кишки. Поэтому снижение уровней ЛЖК при вирусных ОКИ менее значительно, и в ряде случаев они практически не отклоняются от нормы, что свидетельствует о стабильности функциональной активности микрофлоры кишечника.