Роль Т-кадгерина в регуляции роста кровеносных сосудов

Формирование и нарастание тяжести атеросклеротических поражений обусловлено интенсивным ростом кровеносных сосудов в адвентиции и самих поражениях. Ключевыми регуляторами роста и созревания сосудов являются кадгерины [1, 2], которые представляют собой семейство трансмембранных рецепторов, опосредующих зависимое от Ca²⁺ гомофильное узнавание и межклеточное взаимодействие. Клетки сердечно-сосудистой системы, включая эндотелий, перициты и гладкомышечные клетки (ГМК), содержат VE-кадгерин и N (R)-кадгерин [1–3], которые обеспечивают взаимодействие клеток сосудистой стенки друг с другом и поддерживают ее целостности [4, 5].
   Клетки артериальной стенки, помимо известных кадгеринов, содержат нетипичный представитель кадгеринового семейства – Т-кадгерин, который в отличие от “классических” кадгеринов закреплен в плазматической мембране посредством гликозилфосфатидилинозитольного (ГФИ) якоря и не имеет трансмембранный и цитоплазматический домен [6]. Такая структурная особенность свидетельствует о том, что Т-кадгерин не участвует в межклеточной адгезии, а, по-видимому, играет роль сигнального рецептора на поверхности клетки [5, 7, 8]. Нами установлено, что в ГМК артериальной стенки Т-кадгерин опосредует гормоноподобные сигнальные эффекты липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) [9, 10]. Кроме того, на клетках сосудистой стенки Т-кадгерин также является рецептором высокомолекулярных комплексов адипонектина [11]. Этот белок представляет собой уникальный адипоцитарный гормон, который участвует в регуляции обмена липидов и глюкозы [12]. Адипонектин также способен подавлять рост клеток артериальной стенки и препятствовать ее ремоделированию при формировании атеросклеротических поражений или после баллонной ангиопластики. Гиперэкспрессия Т-кадгерина в эндотелиальных клетках вены пуповины человека (HUVEC) вызывает изменения цитоскелета в этих клетках и повышает их миграционную активность [13, 14]. При исследовании каскадов внутриклеточной сигнализации, опосредующих эффекты Т-кадгерина, обнаружено, что гомофильное взаимодействие между молекулами этого белка, располагающихся на соседних эндотелиальных клетках, приводит к активации малых связывающих GТР белков, RhoA/ROCK и Rac, с последующей реорганизацией актинового цитоскелета и формированием стресс-фибрилл [13].
   Экспрессия Т-кадгерина в эндотелиальных клетках, ГМК и перицитах артериальной стенки увеличивается при нарастании тяжести атеросклеротических поражений [15]. Кроме того, на модели баллонной ангиопластики сонной артерии крысы было установлено, что поздние стадии формирования неоинтимы также сопровождаются повышением экспрессии Т-кадгерина клетками сосудистой стенки. Увеличение экспрессии Т-кадгерина в vasa vasorum адвентиции поврежденных сосудов при рестенозе и атеросклерозе, а также при неоангиогенезе, сопровождающем опухолевый рост, свидетельствует о том, что Т-кадгерин может являться одним из регуляторов патологического ангиогенеза [16, 17].
   Данное исследование было посвящено выяснению роли Т-кадгерина в регуляции роста кровеносных сосудов. На модели ангиогенеза в подкожном имплантате матригеля было установлено, что Т-кадгерин подавляет рост кровеносных сосудов. Результаты экспериментов in vitro позволяют предположить, что этот эффект обусловлен гомофильным взаимодействием молекул Т-кадгерина на поверхности эндотелиальных клеток и строме матригеля, вызывающим торможение миграции этих клеток.   

Материалы и методы
   Подкожная имплантация матригеля мышам. Для исследования влияния Т-кадгерина на рост кровеносных сосудов in vivo нами была создана модель локальной сверхэкспрессии Т-кадгерина. Для имплантации использовали клетки линии L929, стабильно экспрессирующие Т-кадгерин человека или контрольную плазмиду (pcDNA 3.1, "Invitrogen") [10, 14]. Клетки L929 культивировали на среде ДМЕМ, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС), 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина в инкубаторе при 37°C, 95% воздуха и 5% CO₂.
   Мышам линии NUDE под авертиновым наркозом (2,5% раствор авертина интраперитонеально) подкожно вводили 1,7ґ10⁶ клеток, смешанных с 400 мкл холодного (4°C) матригеля (BD Biosciences). Животных умерщвляли через 3, 7, 10 и 14 дней после имплантации и извлекали матригели для последующего анализа. Бляшки матригеля взвешивали, разделяли на две части, в одной из которых оценивали содержание гемоглобина, а вторую замораживали в жидком азоте в среде для замораживания образцов O.C.T. Compound (“Sakura Inc.”, Япония) для последующего иммунофлюоресцентного анализа.
   Оценка содержания гемоглобина. Содержание гемоглобина в имплантатах матригеля оценивали с помощью метода Драбкина, модифицированного для тканей. Для этого фрагменты матригеля гомогенизировали в 200 мкл 0,9% раствора NaCl и центрифугировали при 5000 rpm в течение 7 мин. К полученному супернатанту добавляли хлороформ (100 мкл на 50 мкг матригеля) и центрифугировали при 13 000 rpm в течение 3 мин. К супернатанту добавляли 150 мкл гемолитика – концентрированного раствора Драбкина, и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем раствор центрифугировали в течение 2 мин при 13 000 rpm, объем полученного раствора гемцианида доводили до 0,5 мл с помощью 0,9% раствора NaCl и измеряли поглощение в нем при длине волны (l), равной 594 нм.
   Выявление сосудов с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания. Кровеносные сосуды выявляли с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания замороженных срезов матригеля (толщиной 6 мкм), используя моноклональные антитела крысы, узнающие маркерный антиген эндотелия сосудов мыши, CD31 (“BD Pharmigen”) и вторичные антитела осла против крысы, конъюгированные с флюорохромом Alexa595 (“Molecular Probes”), как описано ранее [18, 19]. Зрелые сосуды оценивали с помощью двойного иммунофлюоресцентного окрашивания срезов матригеля антителами против CD31 мыши и антителами против гладкомышечного актина (aSMA) (“Epitomics”) или маркера перицитов NG2 (“Chemicon”). В этом случае использовали вторичные антитела осла против IgG крысы, конъюгированные с флюорохромом Alexa595 (“Molecular Probes”), и антитела осла против IgG кролика, конъюгированные с флюорохромом Alexa488 (“Molecular Probes”). Полученные препараты анализировали при помощи флюоресцентного микроскопа “ZeissAxiovert 200M”. Документирование изображений проводили с помощью цифровой видеокамеры AxioCam HRc и обработки в программе “Axiovision” (“Zeiss”, Германия).
   Подсчет сосудов и статистический анализ. Размер сосудов и их плотность оценивали с помощью программного обеспечения “MetaMorph 5.0” (“Universal Imaging”) и “ClickCounter”. Плотность сосудов подсчитывали на срезах в 4–5 полях зрения (площадь поля зрения – 1,107 мм²) на трех случайных срезах для каждой бляшки матригеля при увеличении 100. При этом выделяли капилляры (CD31-положительные образования без просвета или длиной менее 20 мкм), сосуды среднего диаметра (CD31-положительные образования длиной 20–40 мкм) и крупные сосуды (диаметром более 40 мкм); число сосудов в каждой группе подсчитывали отдельно. Полученное число сосудов в каждом поле зрения нормировали на единицу площади среза.
   Оценка пролиферация эндотелиальных клеток (HUVEC). Влияние Т-кадгерина на пролиферацию HUVEC изучали с помощью сокультивирования эндотелиальных клеток с клетками, экспрессирующими Т-кадгерин, взятыми в соотношениях 5:1, 2:1 или 1:1, на стеклах, покрытых фибронектином (“Sigma”) в CO₂-инкубаторе в течение 48 ч. Число делящихся клеток определяли с помощью подсчета клеток, содержащих ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), который выявляли с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания антителами мыши против PCNА человека (“DakoCytomation”) в сочетании со вторыми антителами против мыши, конъюгированными с флюорохромом Alexa594 (“Molecular Probes”). Число PCNA-позитивных эндотелиальных клеток подсчитывали в 4–5 полях зрения на каждом стекле при увеличении 200. Полученное число клеток нормировали на общее количество HUVEC в каждом поле зрения.
   Адгезия HUVEC. Влияние Т-кадгерина на адгезию изучали на модели прикрепления HUVEC к пластику, покрытому растворами EC1 или ЕС5 рекомбинантых доменов Т-кадгерина, полученных ранее [20], бычьим сывороточным альбумином (БСА), или к монослою клеток, экспрессирующих Т-кадгерин. Для этого HUVEC метили ацетилированными ЛПНП, конъюгированными с флюорохромом Alexa488 (“Invitrogen”). Далее 8ґ10⁴ HUVEC высевали в лунки 24-луночных планшетов, покрытых 0,2% раствором желатина, содержащим 0,1 мг/мл рекомбинантных доменов Т-кадгерина или БСА, и инкубировали в течение 2 ч. По окончании инкубации клетки промывали фосфатно-солевым буфером и подсчитывали их число.
   Апоптоз. Влияние Т-кадгерина на апоптоз эндотелиальных клеток оценивали по активности каспазы-3 в этих клетках с помощью набора реагентов для колориметрического измерения активности каспазы-3 (“Сaspase-3 Colorimetric Assay”, “R&D Systems”, “CN BF3100”) согласно инструкциям производителя. В качестве положительного контроля для индукции апоптоза в культуру эндотелиальных клеток добавляли 1 нМ стауроспорина (“Sigma”) и культивировали в течение 18 ч, после чего готовили клеточные лизаты, как описано ранее. Измерение поглощения в полученных растворах проводили при l, равной 405 нм. Эксперименты проводили в трех параллелях и повторяли 3 раза.
   Формирование капилляроподобных структур. Для оценки формирования капилляроподобных структур 5ґ10⁴ HUVEC высевали на 24-луночный планшет, покрытый матригелем без факторов роста (BD Biosciences), и инкубировали в среде культивирования для эндотелиальных клеток, как указано ранее, при 37^оС в течение 24 ч [21]. Для определения влияния иммобилизованного Т-кадгерина на формирование капилляров, матригель в течение 12 ч пропитывали 0,1 мг/мл растворами доменов EC1 или EC5. Суммарную длину формирующихся капилляроподобных структур оценивали в 5 случайных полях зрения в каждой лунке, используя программу “MetaMorph 5.0” (“Universal Imaging”). Эксперименты повторяли трижды в 3 параллелях.
   Отрастание сосудов от экспланта аорты крысы. Влияние Т-кадгерина на ангиогенез in vitro изучали на модели органной культуры сосудистого колечка крыс в матригеле [22]. Для этого грудную часть аорты самцов крыс тщательно очищали от окружающих тканей, нарезали на колечки длиной 3 мм и полимеризовали в матригеле без факторов роста (“BD Biosciences”), содержащем ЕС1- или ЕС5-домены Т-кадгерина в концентрации 0,0004–0,02 мг/мл. Экспланты инкубировали в СО₂-инкубаторе при 37оC в течение 14 дней, регистрируя образование капилляроподобных структур через 1 день. Эксперименты повторяли 4 раза в трех параллелях. Зону, занимаемую ветвящимися капиллярами, а также среднюю длину отрастающих капилляров анализировали с помощью программы “MetaMorph 5.0” (“Universal Imaging”) и нормировали на единицу (1 мм) боковой поверхности аорты.
   Миграция HUVEC в камере Бойдена. Влияние Т-кадгерина на миграцию HUVEC изучали в камере Бойдена с использованием мембраны с размером пор 8 мкм (“NeuroProbe, Inc.”), как описано ранее [23]. Для этого верхнюю часть мембраны инкубировали в 0,2% растворе желатина, содержащем 0,1 мг/мл рекомбинантных ЕС1- или ЕС5-доменов. После инкубации мембраны в течение 12 ч при 37^оС на нее высаживали HUVEC (1ґ10⁵ на лунку). Миграцию HUVEC проводили в течение 4 ч при 37°C, используя в качестве аттрактанта среду ДМЕМ с ФТС в концентрации 1–10%. По окончании миграции мембрану с промигрировавшими клетками окрашивали красителем DIFF-QUICK, сканировали и анализировали полученные изображения с помощью программы “Image-J” (“National Institute of Health”). Эксперименты проводили в 5–6 параллелях и повторяли 3 раза.
   Статистический анализ всех данных проводили с помощью критерия Манна–Уитни (Statistica 6.0).

Результаты
   Модель локальной сверхэкспрессии Т-кадгерина. Для исследования влияния Т-кадгерина на рост кровеносных сосудов in vivo мы создали модель локальной сверхэкспрессии Т-кадгерина. Для этого клетки линии L939, экпрессирующие Т-кадгерин, были имплантированы в матригеле мышам линии NUDE. Имплантированные клетки сохраняли жизнеспособность и экспрессировали Т-кадгерин на протяжении всего эксперимента. Бляшки матригеля извлекали через 3, 7, 10 или 14 сут после инъекции и оценивали степень васкуляризации матригеля сосудами, отрастающими от a. subclavia. Во всех случаях имплантаты матригеля с клетками линии L939, гиперэкспрессирующими Т-кадгерин, макроскопически отличались от контрольных (были меньшего размера, веса, а также имели более желтый оттенок).
   Через 14 дней после имплантации масса бляшек, содержащих клетки, сверхэкспрессировавшие Т-кадгерин, была достоверно меньше контрольных (0,28±0,02 и 0,45±0,02 г соответственно, p<0,01). Это различие было обусловлено, по-видимому, значительно меньшей васкуляризацией опытных имплантатов матригеля. Действительно, бляшки с клетками, экспрессирующими Т-кадгерин, содержали достоверно меньше гемоглобина (0,74 ± 0,04 единиц оптической плотности – ед. опт. пл.) на 1 г матригеля по сравнению с 1,17±0,08 в контроле; p<0,05. Разница в содержании гемоглобина, отражающая уровень кровоснабжения бляшек, стала очевидной к 10-му дню, что соответствует времени, необходимому для прорастания сосудов и образования сосудистой сети в матригеле [18, 24]. По данным анализа динамики прорастания сосудов с 3-го по 14-й день после имплантации, содержание гемоглобина в бляшках матригеля с клетками, сверхэкспрессирующими Т-кадгерин, было ниже контрольных на всех этапах исследования (рис. 1). Это свидетельствует о том, что гиперэкспрессия Т-кадгерина подавляет прорастание сосудов в матригель.
   Экспрессия Т-кадгерина подавляет образование капилляров, но не влияет на формирование зрелых сосудов. Для выяснения, на какую стадию формирования сосудов (образование и рост или на созревание сосудов) влияет присутствующий в окружающей ткани Т-кадгерин, нами проанализированы плотность сосудов, их размер и качественный состав на срезах матригеля методом иммунофлюоресцентного окрашивания на разные маркеры сосудов. Срезы матригеля с разных частей бляшки окрашивали антителами против маркера эндотелиальных клеток CD31 (рис. 2, а, б, в, г, д). В зависимости от размера все сосуды были условно разделены на три группы: крупные сосуды диаметром более 40 мкм и/или просветом, сосуды среднего размера с диаметром от 20 до 40 мкм и капилляры диаметром менее 20 мкм. Разницы по плотности крупных сосудов в матригеле с гиперэкспрессирующими Т-кадгерин клетками и в контрольных бляшках не наблюдалось: 1,25±0,22 и 1,27±0,33 соответственно; p>0,05. В то время как в сосудах среднего диаметра (91,5±7,2; в контроле – 207,6±9,7; p<0,05) и капиллярах (рис. 2, д) плотность сосудов была достоверно ниже в матригелях с гиперэкспрессирующими Т-кадгерин клетками, чем в контроле. В матригелях с контрольными L929 клетками большинство сосудов экспрессировали Т-кадгерин. Однако в матригелях, в которых L929 клетки экспрессировали Т-кадгерин, Т-кадгерин-позитивных сосудов было значительно меньше, чем в контроле (рис. 2, в, г, д). Таким образом, экспрессия Т-кадгерина в матригеле влияет на прорастание сосудов в бляшку, вызывая достоверное снижение плотности сосудов среднего размера и капилляров.
   Одной из возможных причин снижения плотности сосудов в бляшках матригеля с гиперэкспрессирующими Т-кадгерин клетками могло быть негативное влияние Т-кадгерина на стабилизацию новообразующихся сосудов. Для ответа на вопрос, влияет ли локальная экспрессия Т-кадгерина фибробластами L929 на созревания прорастающих сосудов в матригеле, нами оценена плотность зрелых сосудов, окруженных перицитами или ГМК. Зрелые сосуды выявляли двойным иммунофлюоресцентным окрашиванием антителами против маркера эндотелильных клеток CD31 в сочетании с антителами против a-гладкомышечного актина или антителами против NG2-антигена – маркера перицитов [25, 26]. Разницы между плотностью зрелых сосудов (CD31/a-актин или CD31/NG2-позитивные сосуды) в контрольных матригелях и в матригелях, содержащих Т-кадгерин-позитивные L929 клетки, обнаружено не было (рис. 3). Эти данные позволяют утверждать, что гиперэкспрессия Т-кадгерина в строме матригеля in vivo достоверно подавляет прорастание сосудов в бляшках, но не влияет на их созревание.
   Рекомбинантные фрагменты Т-кадгерина активно используются в экспериментах in vitro для оценки эффектов кадгеринов на адгезию, пролиферацию и сортинг клеток [20, 27]. Для выявления возможного влияния Т-кадгерина на адгезию, пролиферацию, апоптоз и миграцию эндотелиальных клеток in vitro нами использовались рекомбинантные фрагменты Т-кадгерина (ЕС1 и ЕС5).
   Рекомбинантный аминотерминальный домен Т-кадгерина подавляет ангиогенез in vitro. Для подтверждения предположения о том, что Т-кадгерин является ингибитором ангиогенеза, использовали рекомбинантные фрагменты Т-кадгерина для подавления формирования и роста капиллярных трубочек в матригеле, а также на модели сосудистого колечка in vitro. Аминотерминальный EC1 и С-концевой примембранный EC5 домены Т-кадгерина были выделены и очищены в стерильных условиях. Рекомбинантный Т-кадгерин и его фрагменты использовали в ряде работ, в которых изучали in vitro эффекты Т-кадгерина на клеточную адгезию и фенотип [20]. EC1-домен кадгеринов имеет определяющее значение для межклеточного узнавания и формирования контактов, в то время как домен EC5 часто используют в качестве негативного контроля [27]. Культивирование HUVEC, которые эндогенно экспрессируют Т-кадгерина, с растворимыми доменами Т-кадгерина ЕС1 и ЕС5 в концентрации 0,1 мг/мл не влияло на формирование капилляроподобных структур на матригеле in vitro. Однако при иммобилизации домена ЕС1 на поверхности матригеля (но не домена ЕС5) подавлялось формирование трубочек (рис. 4). В соответствии с этими данными были получены результаты на модели сосудистого колечка крысы: иммобилизация домена ЕС1 в матригеле снижала в 2–3 раза рост и ветвление капилляров по сравнению с контрольным доменом ЕС5. Этот эффект домена ЕС1 Т-кадгерина наблюдался в течение всего эксперимента (с 3 по 14-й день) и был зависимым от дозы (рис. 5). Результаты свидетельствуют о том, что растворенные фрагменты Т-кадгерина не влияют на рост и ветвление капилляров, в то время как иммобилизованный домен ЕС1 Т-кадгерина, по-видимому, имитирует гомофильное взаимодействие между клетками [25], что значительно подавляет ангиогенез на моделях in vitro.
   Т-кадгерин подавляет миграцию эндотелиальных клеток, но не влияет на их адгезию, пролиферацию и апоптоз. Для дальнейшего изучения механизма подавления ангиогенеза в присутствии Т-кадгерина исследовали его действие на адгезию, пролиферацию и апоптоз эндотелиальных клеток. Пролиферацию эндотелиальных клеток оценивали по уровню экспрессии белка PCNA. При сокультивировании HUVEC с клетками линий L929 или HEK293, экспрессирующими Т-кадгерин или контрольную плазмиду, достоверной разницы в количестве PCNA-позитивных эндотелиальных клеток не наблюдалось (рис. 6, а, б, в). Также при изучении адгезии HUVEC на пластике, покрытом доменами ЕС1 или ЕС5 или БСА, достоверной разницы по прикрепившимся эндотелиальным клеткам зарегистрировано не было. Аналогично экспрессия Т-кадгерина не влияла на адгезию эндотелиальных клеток на монослой L929 клеток, экспрессирующих Т-кадгерин, по сравнению с адгезией на монослое контрольных клеток. Более того, культивирование НUVEC на пластике, покрытом доменом ЕС1 Т-кадгерина (0,1 мг/мл), не вызывало активацию каспазы-3, ключевого участника апоптоза в HUVEC (рис. 6, б). Полученные данные позволяют утверждать, что обнаруженные при изучении ангиогенеза ингибиторные эффекты Т-кадгерина не связаны с подавлением адгезии, пролиферации или активацией апоптоза эндотелиальных клеток.
   Анализ миграции эндотелиальных клеток в камере Бойдена через мембрану, покрытую доменами Т-кадгерин, показал, что домен ЕС1, участвующий в межклеточном узнавании, подавляет миграцию HUVEC в 2 раза по сравнению с контрольным доменом ЕС5 (см. рис. 6, в). Это позволяет предположить, что Т-кадгерин опосредует свое негативное влияние на рост сосудов через подавление миграции эндотелиальных клеток. Такое предположение подтверждается и данными, полученными в экспериментах на модели сосудистого колечка крысы (рис. 5) и формирования капиллярных трубочек в матригеле in vitro (рис. 4), где было показано, что домен ЕС1, обеспечивающий гомофильное узнавание, имитирует межклеточное взаимодействие экспрессирующих Т-кадгерин клеток и подавляет такие связанные с миграцией процессы, как формирование, рост и ветвление капиллярных трубочек.   

Рис. 4. Формирование капилляроподобных структур in vitro клетками HUVEC в матригеле, содержащем домены EC1 или EC5 Т-кадгерина.

Обсуждение
   Во взрослом организме в норме сосудистая система находится в состоянии равновесия, процессы роста или регресса сосудов четко регулируются. Избыточный или недостаточный ангиогенез, как правило, сопутствует опухолевому росту, патологическому ремоделированию сосудов и различным гиперплазиям тканей. Поскольку рост опухолей связан с рекрутированием новых сосудов, подавление ангиогенеза считается перспективным подходом при терапии раковых заболеваний [28, 29].
   Т-кадгерин эндогенно экспрессируется в клетках сердечно-сосудистой системы: в кардиомиоцитах, эндотелии, ГМК и перицитах [15]. Уровень его экспрессии повышается при ряде заболеваний, связанных с избыточным ростом сосудов [15–17, 30]. Однако физиологическая роль Т-кадгерина до сих пор остается невыявленной.
   Увеличение экспрессии Т-кадгерина в сосудистой стенке коррелирует с патологическим ангиогенезом при атеросклерозе и рестенозе [15, 16]. Данные, полученные в настоящем исследовании, являются первым свидетельством того, что Т-кадгерин специфически ингибирует миграцию эндотелиальных клеток и блокирует формирование мелких сосудов и капилляров in vivo и in vitro. нами высказано предположение о том, что для подавления миграции необходимо гомофильное связывание молекул Т-кадгерина: эндотелиальные клетки, эндогенно экспрессирующие Т-кадгерин, взаимодействуют со стромальными, также экспрессирующими Т-кадгерин, или с иммобилизованным доменом ЕС1, имитирующим гомофильное связывание, и это приводит к контактному торможению миграции эндотелиальных клеток [20, 31]. Возможно, что повышение экспрессии Т-кадгерина в сосудистой стенке при развитии атеросклероза и рестеноза является проявлением защитного механизма.
   Гиперэкспрессия Т-кадгерина с использованием вирусной или плазмидной трансфекции изменяет свойства клеток in vitro: усиливает пролиферацию эндотелиальных клеток [20, 32, 33], повышает способность HUVEC и других клеток к спонтанной миграции [10, 14], а также защищает НUVЕС от апоптоза и повышает устойчивость к оксидативному стрессу [34]. Эти данные, полученные на культивированных клетках, коррелируют с результатами исследований in vivo по экспрессии Т-кадгерина в сосудах некоторых опухолей. Так, при формировании легочных метастазов карциномы Левиса (Lewis carcinoma) уровень экспрессии Т-кадгерина повышается в сосудах, прорастающих в опухоль, в то время как в окружающей ткани Т-кадгерин не выявляется [17]. При гепатоклеточной карциноме в эндотелиальных клетках капилляров опухоли при неоваскуляризации экспрессия Т-кадгерина повышается, в то время как в окружающей ткани и в нормальной печени Т-кадгерин не обнаружен [30]. Эти данные свидетельствуют о том, что увеличение экспрессии Т-кадгерина в эндотелиальных клетках in vitro или в сосудах, прорастающих в опухоль, коррелирует с повышенным уровнем ангиогенеза. Однако, как правило, в описанных работах не учитывали роль стромы и ее возможного влияния на процессы ангиогенеза. В отличие от других авторов, нами была использована модель подкожной имплантации матригеля, в которой клетки создают микроокружение с высоким содержанием Т-кадгерина для прорастающих сосудов. В этих условиях мигрирующие эндотелиальные клетки, эндогенно экспрессирующие Т-кадгерин, контактируют с клетками L929, экспрессирующими Т-кадгерин в результате плазмидной трансфекции, что приводит к подавлению прорастания кровеносных сосудов в матригель. Эффект подавления роста сосудов в матригеле зависит от количества инъецированных Т-кадгерин-позитивных клеток. С этими данными in vivo хорошо согласуются результаты исследований, проведенных нами на модели сосудистого колечка in vitro, в которых выявлена дозовая зависимость подавления роста капилляров в присутствии домена ЕС1 в матригеле, что свидетельствует о специфичности наблюдаемых эффектов Т-кадгерина. Нами было высказано предположение о том, что в данном случае гомофильное взаимодействие между молекулами Т-кадгерина на поверхности контактирующих клеток опосредует контактное ингибирование инвазии эндотелиальных клеток в строму матригеля. Эта гипотеза получила подтверждение при изучении качественного и количественного состава прорастающих сосудов в матригель. Присутствие Т-кадгерина в матригеле не влияло на количество крупных сосудов, в то время как плотность мелких сосудов и капилляров была значительно ниже в матригеле с Т-кадгерин-позитивными L929 клетками, чем в контроле. Это позволяет предположить, что Т-кадгерин в строме влияет на начальные стадии неоангиогенеза. Анализ качественного состава сосудов в бляшках показал, что сосуды, которые прорастают в матригель с Т-кадгерин-позитивными L929 клетками, сами в значительной степени перестают экспрессировать Т-кадгерин. Таким образом, экспрессия Т-кадгерина в строме может оказывать влияние на качественный состав сосудов, инфильтрирующих ткань, либо за счет регуляции направления роста сосудов, либо за счет регуляции экспрессии в сосудах Т-кадгерина. Эта гипотеза о навигационной функции Т-кадгерина, гомофильном взаимодействии и контактном ингибировании роста сосудов объясняет, почему подавление экспрессии Т-кадгерина в строме таких опухолей, как базально-клеточный рак, немелкоклеточная карцинома легкого, рак яичников, рак поджелудочной железы и др. коррелирует с негативным прогнозом и развитием заболевания [35–40], а Т-кадгерину приписывается роль супрессора опухолевого роста [17, 41, 42].
   Механизм подавления роста сосудов, который опосредует Т-кадгерин, может быть аналогичен механизму контактного ингибирования роста аксонов в нервной системе, при котором происходит гомофильное взаимодействие между Т-кадгеринами, например, на конце растущего аксона и поверхности окружающих клеток [43, 44]. Накоплено большое количество данных, свидетельствующих в пользу того, что одни и те же молекулы могут осуществлять функцию навигационных рецепторов в нервной и сосудистой системе, более того, существуют данные о взаимной регуляции прорастания нервов и сосудов [45]. Известны по крайней мере четыре семейства таких молекул, выполняющих навигационную функцию и опосредующих процессы “отталкивания” или адгезии клеток: нетрины и их рецепторы DCC/неогенины и Unc5, слит лиганды и их Робо-рецепторы, семафорины и их рецепторы плексины и нейропилины, эфрины и их рецепторы [46, 47]. Т-кадгерин является еще одной молекулой с навигационной функцией, регулирующей направление роста нервов и сосудов через окружающие ткани к своим мишеням (рис. 7). Эфрины и их рецепторы – пара навигационных молекул, осуществляющих регуляцию роста нервов и сосудов в эмбриогенезе, а также при опухолевом , а также при опухолевом ангиогенезе [48, 49]. Эфрины класса А являются, как и Т-кадгерин, заякоренными ГФИ-молекулами [49, 50]. Результатом взаимодействия эфринов со своими рецепторами является либо адгезия клеток, либо их "отталкивание". Механизм передачи сигнала внутрь клетки через заякоренные ГФИ-эфрины не ясен, но, по-видимому, происходит кластеризация молекул эфринов в липидных плотах и/или участвуют адапторные белки. Еще меньше известно о механизмах внутриклеточной сигнализации и белках-партнерах Т-кадгерина, но, возможно, они аналогичны эфриновым, поскольку сходное строение позволяет предположить наличие аналогичных механизмов активации внутриклеточной сигнализации.
   О Т-кадгерине было известно, что in vivo он экспрессируется в эмбриогенезе в нервной системе мигрирующими клетками нервного гребня и прорастающими к мишеням аксонами, которые избегают на своем пути ткани, в которые экспрессирован Т-кадгерин [6, 43, 44]. При этом Т-кадгерин выполняет функцию навигационного рецептора, опосредующего “отталкивание” и контактное ингибирование при гомофильном взаимодействии контактирующих экспрессирующих Т-кадгерин клеток. Теперь наши данные, полученные в экспериментах in vitro по миграции HUVEC в камере Бойдена при формировании капилляров клетками HUVEC в матригеле или на модели сосудистого колечка с использованием домена ЕС1 [20], позволяют утверждать, что Т-кадгерин участвует в навигации прорастающих сосудов по такому же принципу. In vivo экспрессия Т-кадгерина клетками L929 в матригеле создает микроокружение с высоким содержанием Т-кадгерина для прорастающих в бляшку сосудов, что тормозит начальные этапы ангиогенеза, но не влияет на созревание сосудов. Механизм действия Т-кадгерина заключается в подавлении миграции эндотелиальных клеток; однако присутствие Т-кадгерина не влияет на их пролиферацию, адгезию и апоптоз. Т-кадгерин является ингибитором ангиогенеза в системах in vivo и in vitro.
   Современная медицина представляет опухоль и окружающую ее строму как единую систему, причем опухолевая строма больше не рассматривается как инертное микроокружение для растущей опухоли [51]. “Активированные фибробласты” в опухоли могут стимулировать начальные этапы ангиогенеза, метастазирование и пролиферацию опухолевых клеток, в то время как инъекции нормальных фибробластов в опухолевую строму подавляют рост опухоли [51]. Таким образом, инъекции клеток, гиперэкспрессирующих Т-кадгерин, или генетических конструкций, несущих ген Т-кадгерина, потенциально могут быть использованы для подавления опухолевого ангиогенеза и избыточного ангиогенеза в атеросклеротической бляшке или формирующейся неоинтиме.
   

Литература
1. Cavallaro U, Leibner S, Dejana E. Endothelial cadherins and tumor angiogenesis. Exp Cell Res 2006; 312: 659–67.
2. George SJ, Beeching CA. Cadherin:catenin complex: A novel regulator of vascular smooth muscle cells behaviour. Atherosclerosis 2006; 188: 1–11.
3. Rubina KA, Kalinina NI, Bochkov VN et al. T-cadherin as an antiadhesive and guidance molecule interacting with low density lipioproteins. Annals EAS 2005; 1–14.
4. Gumbiner BM. Regulation of cadherin-mediated adhesion in morphogenesis. Nature Rev Mol Cell Biol 2005; 6: 622–34.
5. Perez-Moreno M, Jamora C, Fuchs E. Sticky business: orchestrating cellular signals at adherens junctions. Cell 2003; 112: 535–48.
6. Ranscht B, Dours-Zimmermann MT. T-cadherin, a novel cadherin cell adhesion molecule in the nervous system lacks the conserved cytoplasmic region. Neuron 1991; 7: 391–402.
7. Rubina KA, Tkachuk VA. Antiadhesive molecule T-cadherin is an atypical low-density lipoprotein receptor in vascular cells. R.J. Physiol 2004; 90: 968–86.
8. Philippova MP, Bochkov VN, Stambolsky DV et al. T-cadherin and signal-transducing molecules co-localize in caveolin-rich membrane domain of vascular smooth muscle cells. FEBS Letters 2004; 129: 201–10.
9. Tkachuk VA, Bochkov VN, Philippova MP et al. Identification of an atypical lipoprotein-binding protein from human aortic smooth muscle as T-cadherin. FEBS Lettters 2004; 421: 208–12.
10. Rubina K, Talovskaya E, Cherenkov V et al. LDL induces intracellular signaling via atypical LDL-binding protein T-cadherin. Mol Cell Biochem 2005; 273: 33–41.
11. Hug C, Wang J, Ahmad NS et al. T-cadherin is a receptor for hexameric and high-molecular weight forms of Acrp30/adiponectin. PNAS 2004; 101 (28): 10308–13.
12. Brakenhielm E, Veitonmaki N, Cao R et al. Adiponectin-induced antiangiogenesis and antitumor activity involve caspase-mediated endothelial cell apoptosis. PNAS 2004; 101 (8): 2476–81.
13. Philippova M, Ivanov D, Allenspach R et al. RhoA and Rac mediate endothelial cell polarization and detachment induced by T-cadherin. FASEB J 2005; 19: 588–90.
14. Philippova M, Ivanov D, Tkachuk V et al. Polarisation of T-cadherin to the leading edge of migrating vascular cells in vitro: a function in vascular cell motility? Histochem Cell Biol 2003; 120: 353–60.
15. Ivanov D, Philippova M, Antropova J et al. Expression of cell adhesion molecule T-cadherin in the human vasculature. Histochem Cell Biol 2001; 115: 231–42.
16. Kudrjashova E, Bashtrikov P, Bochkov V et al. Expression of adhesion molecule T-cadherin is increased during neointima formation in experimental restenosis. Histochem Cell Biol 2002; 118: 281–90.
17. Wyder L, Vitaliti A, Schneider H et al. Increased expression of H/T-cadherin in tumor-penetrating vessels. Cancer Res 2000; 60: 4682–8.
18. Passaniti A, Taylor RM, Pili R et al. A simple quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest 1992; 67: 519–28.
19. Staton CA, Stribbling SM, Tazzyman S et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J Exp Path 2004; 85: 233–48.
20. Ivanov D, Philippova M, Tkachuk V et al. Cell adhesion molecule T-cadherin regulates vascular cell adhesion, phenotype and motility. Exp Cell Res 2004; 293: 207–18.
21. Nagata D, Mogi M, Walsh K. AMP-activated protein kinase (AMPK) signaling in endothelial cells is essential for angiogenesis in response to hypoxic stress. J Biol Chem 2003; 278: 31000–6.
22. Nicosia RF, Ottinetti A. Modulation of microvascular growth and morphogenesis by reconstituted basement membrane gel in three-dimensional cultures of rat aorta: a comparative study of angiogenesis in matrigel, collagen, fibrin, and plasma clot. Vitro Cell Dev Biol 1990; 26: 119–28.
23. Kim KS, Hong YK, Joe YA et al. Antiangiogenic activity of the recombinant kringle domain of urokinase and its specific entry into endothelial cells. J Biol Chem 2003; 278: 11449–56.
24. Stieger SM, Bloch SH, Foreman O et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a Matrigel model in rats. Ultrasound in Med Biol 2006; 32: 673–81.
25. Gerhardt H, Betsholtz C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell Tissue Res 2003; 314: 15–23.
26. Bergers G, Song S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology 2005; 7: 452–64.
27. Niessen CM, Gumbiner BV. Cadherin-mediated cell sorting not determined by binding or adhesion specificity. J Cell Biol 2002; 156: 389–99.
28. Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med 1971; 285: 1182–6.
29. Cao Y. Tumor angiogenesis and therapy. Biomedicine and Pharmacotherapy. 2005; 9: 340–3.
30. Adachi Y, Takeuchi T, Sonobe H, Ohtsuki Y. An adiponectin receptor, T-cadherin, was selectively expressed in intratumoral capillary endothelial cells in hepatocellular carcinoma: possible cross talk between T-cadherin and FGF-2 pathways. Virchows Arch 2005; 5: 1–8.
31. Zhong Y, Lopez Barcons L, Haigentz M et al. Exogenous expression of H-cadherin in CHO cells regulates contact inhibition of cell growth by inducing p21 expression. Int J Oncol 2004; 24: 1573–9.
32. Ivanov D, Philippova M, Allenspach R et al. T-cadherin upregulation correlates with cells-cycle progression and promotes proliferation of vascular cells. Cardiovasc Res 2004; 64: 132–43.
33. Philippova M, Banfi A, Ivanov D et al. Atypical GPI-anchored T-cadherin stimulates angiogenesis in vitro and in vivo. Artherioscler Thromb Vasc Biol 2006; 26: 2222–3.
34. Joshi MB, Philippova M, Ivanov D et al. T-cadherin protects endothelisl cells from oxidative stress-induced apoptosis. FASEB J 2005; 19: 1737–9.
35. Kawakami M, Staub J, Clibi W et al. Involvement of H-cadherin (CDH13) on 16q in the region of frequent deletion in ovarian cancer. Int J Oncol 1999; 15: 715–20.
36. Takeuchi T, Liang S-B, Ohtsuki Y. Downregulation of expression of a novel cadherin molecule, T-cadherin, in basal cell carcinoma of the skin. Mol Cancerogen 2002; 35: 173–9.
37. Hibi K, Nakayama H, Kodera K et al. CDH13 promoter region is specifically methylated in poorly differentiated colorectal cancer. Brit J Cancer 2004; 90: 1030–3.
38. Sakai M, Hibi K, Koshikawa K et al. Frequent promoter methylation and gene silencing of CDH13 in pancreatic cancer. Cancer Sci 2004; 95: 588–91.
39. Kim JS, Han J, Shim YM et al. Abberant methylation of H-cadherin (CDH13) promoter is associated with tumor progression in primary nonsmall cell lung carcinoma. Cancer 2005; 104: 1825–33.
40. Mukoyama Y, Zhou S, Miyachi Y, Matsuyoshi N. T-cadherin negatively regulates the proliferation of cutaneous squamous carcinoma cells. J Invest Dermatol 2005; 124: 833–8.
41. Takeuchi T, Misaki A, Liang SB et al. 2005Expression of T-cadherin (CDH13, H-cadherin) in human brain and its characteristics as a negative growth regulator of epidermal growth factor in neuroblastoma cells. J Neurochem 2005; 74: 1489–97.
42. Takeuchi T, Ohtsuki Y. Recent progress in T-cadherin (CDH13, H-cadherin) research. Histol Histopathol 2001; 16: 1287–93.
43. Fredette BJ, Ranscht B. T-cadherin expression delineates specific regions of the developing motoraxon-hindlimb projection pathway. J Neurosci 1994; 14: 7331–46.
44. Fredette BJ, Miller J, Ranscht B. 1994Inhibition of motor axon growth by T-cadherin substrata. Development 1994; 122: 3163–71.
45. Carmeliet P. Blood vessels and nerves: common signals, pathways and diseases. Nature Genet 2003; 4: 710–20.
46. Weinstein BM. Vessels and nerves: marching to the same tune. Cell 2005; 120: 299–302.
47. Eichmann A, Makinen T, Alitalo K. Neural guidance molecules regulate vascular remodeling and vessel navigation. Genes Dev 2006; 19: 1013–21.
48. Adams RH, Wilkinson GA, Weiss C et al. Roles of ephrinB ligands and EphB receptors in cardiovascular development: demarcation of arterial-venous domains, vascular morphogenesis, and sprouting angiogenesis. Genes Dev 1999; 13: 295–306.
49. Poliakov A, Cortina M, Wilkinson DG. Diverse roles of Eph receptors and Ephrins in the regulation of cell migration and tissue assembly. Dev Cell 2004; 7: 465–80.
50. Davy A, Soriano P. Ephrins in vivo: look both ways. Dev Dynamics 2005; 232: 1–10.
51. Desmouliere A, Guyot C, Gabbiani G. The stroma reaction myofibroblast: a key player in the control of tumor behavior. Int J Dev Biol 2004; 48: 509–17.
52. Kalluri R, Zeisberg M. Fibroblasts in cancer. Nature Rev Cancer 2004; 6: 392–401.