Реперфузия метаболическими протекторами уменьшает гибель кардиомиоцитов после окклюзии коронарной артерии у крыс

   Показатели кислотно-щелочного баланса артериальной крови контролировали на кислотно-щелочном газоанализаторе “ABL-30” (“Radiometer”) и поддерживали на физиологическом уровне в течение всего опыта.
   Протоколы опытов. По окончании препарирования животных и стабилизации в течение 30 мин гемодинамических показателей (исходное состояние) для создания региональной ишемии на 40 мин окклюзировали ПНА. Продолжительность последующей реперфузии составляла 60 мин. В течение всего периода реперфузии в яремную вену со скоростью 1 мл/кг/ч вводили физиологический раствор (контроль). Эффективность защиты ишемизированного миокарда с помощью метаболических протекторов оценивали в отдельных сериях опытов, вводя с той же скоростью во время реперфузии К-Мg-Асп (K-аспартат 2,6 М, Mg-(аспартат)2 2,75 М); ГИК (глюкоза 2,8 М, И 100 МЕ/л, K⁺ 0,1 М), ГИКАсп (глюкоза 2,8 М, И 100 МЕ/л, K-аспартат 0,1 М) или И (100 МЕ/л в физиологическом растворе). Оптимальное содержание компонентов в составе протекторов и их дозы введения были подобраны, исходя из имеющихся в литературе данных, и оценены в сериях предварительных опытов на используемой модели ИМ.
   Измерение размеров ИМ. Срезы ЛЖ толщиной около 1,5 мм инкубировали 10 мин в 1% растворе 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида, растворенном в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 при 37^оС. Затем их взвешивали для определения общей массы ЛЖ. После подсушивания окрашенные срезы сканировали, размеры ИМ и ЗР определяли методом компьютерной планиметрии, используя программу “Imagecal” [16]. В каждой группе рассчитывали отношения ЗР/ЛЖ и ИМ/ЗР (в %).
   Обработка ткани и анализ метаболитов. По окончании исходного состояния или периода реперфузии ткань ЗР ЛЖ быстро вырезали и замораживали в жидком азоте. Замороженные образцы ткани измельчали в холодной 6% HСlO4 (10 мл/г ткани) и гомогенизировали с помощью “Ultra-Turrax” T225 ("IKA-Labortechnik"). Затем их экстрагировали 20 мин во льду и центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин при 4oС. Супернатанты нейтрализовали 5 М К2СО3 до рН 7,40 и повторно центрифугировали при 4oС для удаления осадка KClO4. Безбелковые экстракты хранили замороженными до определения метаболитов. Сухой вес ткани определяли взвешиванием части осадка ткани после экстракции HClO4, высушенной при 110oС в течение ночи [17]. Концентрации АТФ, фосфокреатина (ФКр), креатина (Кр), аспартата (Асп), глутамата (Глу), лактата и глюкозы определяли спектрофотометрически энзиматическими методами [18].
   Статистическая обработка. Данные представляли как M±m. Отличия между группами оценивали по t-критерию Стьюдента, различия между величинами считали достоверными при p<0,05.

Результаты
   Влияние протекторов на размеры ИМ. Введение физиологического раствора или метаболических протекторов во время реперфузии не влияло на АД и кислотно-щелочное состояние артериальной крови. Во всех группах эти показатели в конце реперфузии не отличались от исходных значений и составляли в среднем: АД – 100±3 мм рт. ст., рН – 7,40±0,03; pCO₂ – 24,5±1,8 мм рт. ст., PO₂ – 299±30 мм рт. ст. Таким образом, животные всех групп были гемодинамически стабильны, и поддерживался адекватный аэробный обмен.
   В экспериментальных группах отношение ЗР/ЛЖ не отличалось от аналогичного показателя в контроле и в среднем составляло 24,2±1,3%, что указывало на стандартное повреждение миокарда при окклюзии ПНА. Отношение ИМ/ЗР составляло 55,5±3,9% в контроле и достоверно снижалось под влиянием всех протекторов (рис. 1). Размеры ИМ в экспериментальных группах, оцененные по этому показателю, снижались в ряду ГИКАсп> К-Мg-Асп>И>ГИК. Существенно, что достоверных различий в размерах ИМ после реперфузии ГИК или И не обнаружено. Это свидетельствует о том, что И играет ключевую роль в защитном эффекте ГИК. Замена К⁺ в смеси ГИК эквимолярным количеством К-аспартата (0,1 М) не приводила к дальнейшему ограничению размеров ИМ по сравнению с этим показателем в группе ГИК. Отношение ИМ/ЗР (в %) в группе ГИКАсп было самым высоким, но достоверно ниже, чем в контроле, поэтому исследование влияния ГИКАсп на метаболизм ЗР не проводили.
   Изменения в метаболическом состоянии ЗР. Содержание макроэргических фосфатов, аминокислот, глюкозы и лактата в ЛЖ сердца крысы до окклюзии ПНА (исходное состояние) соответствовало значениям, указанным в литературе (табл. 1, 2) [5, 8].
   Под влиянием региональной ишемии и последующей реперфузии содержание АТФ и ФКр в ЗР в контроле снижалось до 23,5±2,7 и 31,7±3,6% от исходного соответственно (см. табл. 1). В конце реперфузии содержание макроэргических фосфатов в ЗР сердец, защищенных ГИК, И или К-Мg-Асп, было в 2,5 раза выше, чем в контроле, и в среднем соответствовало 56,3±3,4 и 81,8±7,9% от исходных значений для АТФ и ФКр соответственно. Достоверных различий в содержании АТФ или ФКр в ЗР между экспериментальными группами не обнаружено.
   Низкое содержание АТФ и ФКр в ЗР в контрольной группе в конце реперфузии соответствовало метаболическим сдвигам, характерным для неэффективного восстановления аэробного обмена. К ним относятся высокое содержание продуктов гликолиза/гликогенолиза – лактата и глюкозы в ЗР к концу опыта и сниженное содержание аспарагиновой и глутаминовой кислот (до 6,8±1,6 и 41,1±3,6% от исходных значений соответственно), указывающее на их включение в анаэробный обмен.
   Под влиянием реперфузии с метаболическими протекторами потери фонда аспарагиновой и глутаминовой кислот в ЗР достоверно снижались. Наибольшее содержание как аспарагиновой, так и глутаминовой кислоты в ЗР было отмечено при использовании К-Мg-Асп. В этом случае общий фонд этих аминокислот был в 2 раза выше, чем в контроле, и составлял 67,2±6,6 и 33,5±4,9% от исходного уровня соответственно (p<0,01). Это предполагало транспорт аспарагиновой кислоты в кардиомиоциты и ее последующее трансаминирование в глутаминовую кислоту. Накопление лактата и глюкозы в ЗР уменьшалось в наибольшей степени под влиянием И, что свидетельствовало об активации аэробного гликолиза. При реперфузии с ГИК содержание глюкозы в ЗР было наибольшим, что отражало увеличение не только внутриклеточного, но и внеклеточного содержания глюкозы, а уровень лактата был практически таким же, как и после реперфузии с И. Реперфузия с К-Мg-Асп также достоверно снижала уровни глюкозы и лактата в ЗР по сравнению с контролем.
   Целостность мембран кардиомиоцитов в ЗР оценивали по внутриклеточному маркеру – содержанию общего Кр (SКр=ФКр+Кр). В конце реперфузии этот показатель был минимальным в контроле за счет трехкратного снижения уровня ФКр и Кр (табл. 1) и составлял 32,3±2,3% от исходного содержания SКр (рис. 2). Под влиянием протекторов тканевой фонд SКр сохранялся значительно лучше, чем в контроле. После реперфузии с ГИК и И содержание SКр в ЗР составляло 80,1±4,9 и 78,2±5,6% от исходного уровня соответственно и было достоверно более высоким, чем у крыс группы К-Мg-Асп (63,3±5,5%; p<0,05). Поскольку мембрана интактных кардиомиоцитов непроницаема для ФКр и Кр [19], более высокое содержание SКр предполагает лучшую интегрированность сарколеммы кардиомиоцитов в ЗР при реперфузии с ГИК и И, чем К-Мg-Асп.
   Корреляционный анализ выявил тесную положительную взаимосвязь между средними значениями потерь общего креатина в ЗР (DSКр в % от исходного содержания) и средними значениями отношений ИМ/ЗР (в %) в исследуемых группах (r=0,99; p<0,05; рис. 3). Таким образом, под влиянием протекторов при большем ограничении размеров ИМ лучше сохранялось содержание DКр в ЗР, а следовательно, и меньше были разрывы сарколеммы ишемизированных кардиомиоцитов.

Обсуждение
   Эффективность протекторов при реперфузии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что внутривенное введение всех изучавшихся протекторов на реперфузии увеличивает толерантность постишемических кардиомиоцитов ЗР к реперфузионному повреждению по сравнению с изменениями в контроле. Наибольшее и практически одинаковое снижение необратимого повреждения, охарактеризованное отношением ИМ/ЗР (в %), обеспечивала ранняя реперфузия ГИК и И, в меньшей степени ИМ снижался под действием К-Мg-Асп (см. рис. 1). Включение аспартата К в состав ГИК не увеличивало кардиопротекторную эффективность ГИК. Отсутствие дополнительного защитного эффекта, вероятно, связано как с низким содержанием самого Асп в составе ГИКАсп по сравнению с его содержанием в К-Мg-Асп, так и с отсутствием второго необходимого компонента для проявления протекторных свойств Асп – Мg²⁺.
   Полученные данные непосредственно указывают на метаболическую природу защитного действия использованных реперфузионных составов: ГИК, И и К-Мg-Асп улучшали восстановление аэробного обмена в постишемических кардиомиоцитах. Это подтверждалось более высоким содержанием АТФ и ФКр, лучшим сохранением фонда ключевых аминокислот сердца – Асп и Глу – одновременно со снижением накопления лактата в ЗР в конце реперфузии (см. табл. 1, 2). Также нами была обнаружена тесная корреляция между сохранением содержания SКр в ЗР и снижением размеров ИМ во всех группах (см. рис. 3). В целом восстановление аэробного обмена и уменьшение повреждения мембран кардиомиоцитов, оцененное по содержанию SКр, было максимальным в группах И и ГИК и незначительно ниже после реперфузии К-Мg-Асп. Таким образом, метаболическая эффективность протекторов соответствовала ограничению размеров ИМ и увеличивалась в ряду контроль<К-Мg-Асп<И<ГИК.
   Механизмы защитного действия ГИК. Особый интерес представляет анализ влияния ГИК и И на снижение гибели кардиомиоцитов в ЗР. Ранее защитные механизмы «поляризующей смеси» ГИК связывали с обеспечением электрической стабильности сердца при ишемии [20]. Впоследствии L.Opie и соавт. была разработана метаболическая концепция действия ГИК, основанная на регуляции энергетического обмена [21]. На разных моделях ишемии и реперфузии миокарда было подтверждено, что под влиянием ГИК увеличивается продукция АТФ в гликолизе, лучше сохраняются запасы гликогена, происходит образование пирувата, сопряженное с обеспечением физиологических уровней интермедиатов цикла трикарбоновых кислот [6]. Следствием этого является большая интегрированность плазматических мембран и поддержка ионного гомеостаза кардиомиоцитов. Принципиально важно, что ГИК способен оптимизировать утилизацию энергопродуцирующих субстратов ишемизированным сердцем, снижая уровень циркулирующих в крови СЖК и их захват миокардиальными клетками [22]. В экспериментальных работах и у пациентов, подвергавшихся реваскуляризации коронарных артерий, были обнаружены тесные взаимосвязи между увеличенной экстракцией миокардом глюкозы, метаболическими эффектами ГИК и снижением постишемической дисфункции сердца [10, 23]. Совокупность этих результатов принципиально согласуется с ограничением ИМ при использовании ГИК в период реперфузии, продемонстрированным нами и другими исследователями [6, 11, 13, 14]. Очевидно, что факторами, определяющими уменьшение гибели кардиомиоцитов в ЗР, являются снижение ингибирующего действия СЖК на энергетический обмен, увеличение продукции АТФ при окислении глюкозы, меньшее накопление лактата и H⁺, инициирующее перегрузку ионами Ca²⁺, и развитие дефектов сарколеммы.
   Полученные нами результаты показывают, что основным кардиозащитным компонентом ГИК является И. Это подтверждается как одинаковым снижением размеров ИМ под действием ГИК и одного И (см. рис. 1), так и их сходным влиянием на показатели энергетического обмена, продукцию лактата и содержание аспарагиновой и глутаминовой кислот в ЗР (см. табл. 1, 2). Более того, введение в состав ГИК еще одного потенциального кардиопротектора – Асп – при замене К⁺ эквимолярным количеством К-аспартата (ГИКАсп) не вызывало дальнейшего уменьшения ИМ (см. рис. 1). Это позволяет предположить, что снижение реперфузионного повреждения ЗР под влиянием ГИК прямо не связано с захватом ишемизированными миоцитами глюкозы или К⁺ и может быть обусловлено независимыми кардиопротекторными механизмами. В пользу этого предположения свидетельствует и тот факт, что ГИК в равной степени снижал размеры ИМ у крыс in vivo при внутривенном введении в период ишемии и реперфузии и при введении только во время реперфузии [12]. Однако в последнем случае изменений в содержании СЖК и глюкозы в крови по сравнению с контролем не происходило.
   Активация метаболических и сигнальных путей И. В опытах на изолированном перфузируемом сердце крысы и на животных разных видов in vivo показано, что реперфузия одним И способна восстанавливать функцию сердца и уменьшать размеры ИМ, вызванные ишемическим и реперфузионным стрессом, практически в той же степени, что и ГИК [11, 12]. Эти данные хорошо согласуются с результатами настоящей работы (см. рис. 1). Имеются экспериментальные и клинические подтверждения того, что это может быть вызвано ингибированием И липолиза в жировой ткани, приводящим к снижению концентрации СЖК в крови и уменьшению их экстракции миокардом [24]. Сдвиг в утилизации энергетических субстратов под действием И в пользу углеводов уменьшает бесполезный расход АТФ при включении СЖК в триглицериды и снижает ингибирование окисления глюкозы ацетилкоэнзимом А и цитратом – продуктами окисления СЖК. Следствием этих метаболических перестроек является меньшее повреждение функции митохондрий и накопление Н⁺ в постишемических кардиомиоцитах, способствующее сохранению внутриклеточного ионного гомеостаза и целостности плазматических мембран [7, 9, 14]. Прямые доказательства улучшения восстановления аэробного метаболизма в ЗР и снижение повреждений мембран кардиомиоцитов под действием И были получены в данной работе (см. табл. 1, 2).
   В то же время ранее было экспериментально подтверждено, что И промотирует внутриклеточные сигнальные пути выживания ишемизированных кардиомиоцитов при реперфузии. Так, на модели изолированного сердца крысы показано, что инфузия И на стадии ранней реперфузии уменьшает не только некроз, но и запрограммированную гибель клеток – апоптоз [11, 25]. Причем антиапоптозное действие И не зависит от энергетического субстрата и полностью воспроизводится при замене глюкозы в перфузате пируватом. С помощью ингибиторного анализа было доказано, что этот кардиопротективный фенотип опосредуется сигнальными каскадами, в которых участвуют тирозинкиназа, фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3-киназа) и p70S6-киназа (S6K), а активация сигнальных интермедиатов – протеинкиназы B (Akt) и S6K – происходит при их фосфорилировании И в стадию реперфузии [12]. Кроме того, И при реперфузии поддерживает проапоптозный пептид BAD (Bcl-2/Bcl-XL – агонист, вызывающий гибель клеток) в неактивной фосфорилированной форме. В последние годы был идентифицирован дополнительный сигнальный каскад, инициируемый И в реперфузируемом сердце, мишенью которого является эндотелиальная NO-синтаза [26]. Фосфорилирование этого фермента И через опосредованный PI3-киназой – Akt путь вызывает образование в эндотелии NO, обладающего свойствами не только вазодилататора, но и ингибитора апоптоза [27]. Таким образом, митоген И может действовать как "метаболически независимый" компонент коктейля ГИК, снижая вклад апоптоза в реперфузионное повреждение миокарда.
   Особенности действия К-Мg-Асп. Хотя целесообразность применения аспарагиновой кислоты при остром ИМ давно обоснована экспериментально [3, 28], данные по влиянию К-Мg-Асп на ИМ и метаболизм ЗР в доступной литературе отсутствуют. Механизм его действия связывают с ролью аниона Асп^2- как переносчика ионов K⁺ и Mg²⁺ во внутриклеточное пространство и участием самого Асп^2- в метаболических процессах. Благодаря этому К-Мg-Асп способен уменьшать дисбаланс электролитов, снижать возбудимость и проводимость миокарда, оказывая антиаритмический эффект, и улучшать метаболическое состояние постишемического сердца. Полученные нами результаты показывают, что ограничение размеров ИМ под действием К-Мg-Асп при реперфузии прямо связано с его включением во внутриклеточный обмен. Это подтверждается значительным снижением потерь аспарагиновой кислоты в ЗР к окончанию реперфузии и одновременным увеличением содержания продукта ее метаболизма – глутаминовой кислоты (см. табл. 2). Образование интермедиатов цикла трикарбоновых кислот и активация переноса восстановительных эквивалентов NADH из цитозола в митохондрии в малат-аспартатном челноке в результате сопряженного трансаминирования глутаминовой и аспарагиновой кислот способствует аэробному окислению глюкозы и восстановлению макроэргических фосфатов [3–5]. Об этом свидетельствуют достоверно более низкие уровни лактата и глюкозы (см. табл. 2) и двукратное увеличение содержания АТФ и ФКр в ЗР по сравнению с контролем (см. табл. 1). Кроме того, изменение трансмембранных ионных потоков, вызванное введением К-Мg-Асп, влияет на активность фосфоинозитидной и аденилатциклазной систем в миокарде [2]. Поскольку обе мессенджерные системы находятся в центре влияния гормонов и биологически активных веществ, “быстрые ответы” кардиомиоцитов, обусловленные изменениями мембранных потенциалов, также могут быть ответственны за предотвращение гибели постишемических кардиомиоцитов.

Заключение
   Тромболитическая терапия или первичная ангиопластика являются стандартной помощью при остром ИМ. Очевидно, что восстановления коронарного кровотока и снабжения кислородом ЗР недостаточно для спасения постишемических кардиомиоцитов, и следующей мишенью терапевтического воздействия должен быть миокард, поэтому для успешной миокардиальной защиты в условиях срочной реперфузии необходимо использовать метаболические протекторы. Это, в частности, подтверждают клинические исследования ECLA и DIGAMI, в которых продемонстрирована высокая кардиопротективная эффективность реперфузии ГИК, снижавшая смертность больных с острым коронарным синдромом [29, 30]. Результаты нашей работы, так же как и данные более ранних экспериментальных исследований, указывают на перспективность такого подхода. Применение метаболических протекторов позволяет снижать обе составляющие необратимого повреждения миокардиальных клеток – некроз и апоптоз. Это достигается комплексным воздействием на внутриклеточный обмен и ионный гомеостаз модуляцией активности сигнальных каскадов и мессенджерных систем. Полученные результаты указывают на целесообразность дальнейшего изучения действия этого класса кардиопротекторов в условиях реперфузионного стресса.
   

Литература
1. Verma S, Fedak PWM, Eeisel RD. Fundamentals of reperfusion injury for the clinical cardiologist. Circulation 2002; 105: 2332–6.
2. Вишневский А.А., Берляков А.А. Активность мессенджерных систем в гипертрофированном миокарде крыс при введении панангина. Бюл. экспер. биол. и мед. 2002; 134 (9): 299–302.
3. Rosenfeldt FL, Korchazhkina OV, Richards SM et al. Aspartate improves recovery of the recently infarcted rat heart after cardioplegic arrest. Eur J Cardio-Thorac Surg 1998; 14: 185–90.
4. Snaith ChD, Wright G, Lofkin M. The effects of aspartate and 2-oxoglutarate upon glycolytic energy metabolites and mechanical recovery following global ischemia in isolated rat heart. J Mol Cell Cardiol 1992; 24: 305–15.
5. Pisarenko OI. Metabolic and antioxidant support with amino acids. Ischemia-reperfusion injury in cardiac surgery. Georgetown, Landes Bioscience, 2001; 90–6.
6. Apstein CS, Taegtmeyer H. Glucose-insulin-potassium in acute myocardial infarction. The time has come for a large, prospective trial. Circulation 1997; 95: 1074–7.
7. Lopaschuk GD, Wambolt RR, Barr RI. An imbalance between glycolysis and glucose oxidation for the detrimental effects of high levels of fatty acids during aerobic reperfusion of ischemic hearts. J Pharmacol Exp Ther 1993: 264: 135–44.
8. Cross HR, Radda GK, Clarke K. The role of Na+/K+-ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury: a 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopy study. Magn Reson Med 1995; 34: 673–85.
9. Xu KY, Zweier JL, Becker LC. Functional coupling between glycolysis and sarcoplasmic reticulum Ca²⁺ transport. Circ Res 1995; 77: 88–97.
10. Jonassen AK, Aasum E, Reismersma RA et al. Glucose-insulin-potassium reduces infarct size when administrated during reperfusion. Cardiovasc Drugs and Therapy 2000; 14: 615–23.
11. Zhang HF, Fan Q, Qian XX, Lopez BL et al. Role of insulin in the apoptotic effect of glucose-insulin-potassium in rabbits with acute myocardial ischemia and reperfusion. Apoptosis 2004; 9: 777–83.
12. Jonassen AK, Sack MN, Mjos OD, Yellon DM. Myocardial protection by insulin at reperfusion requires early administration and is mediated via Akt and p70s6 kinase cell-survival signaling. Circ Res 2001; 89: 1191–9.
13. LaDisa JF, Krolikowski JG, Pagel PS et al. Cardioprotection by glucose-insulin-potassium: dependence on KATP channel opening and blood glucose concentration before ischemia. Am J Physiol (Heart Circ Physiol) 2004; 287: H601–7.
14. Angelos MG, Murray HN, Gorsline RT, Klawitter PF. Glucose, insulin and potassium (GIK) during reperfusion mediates improved myocardial bioenergetics. Resuscitation 2002; 55(3): 329–36.
15. Писаренко О.И., Студнева И.М., Серебрякова Л.И. и др. Защита миокарда крыс селективным ингибитором Na⁺/H⁺ обмена и ишемическим прекондиционированием. Кардиология 2005; 45 (2): 37–44.
16. Писаренко О.И., Серебрякова Л.И., Цкитишвили О.В. и др. Влияние ингибирования Na⁺/H⁺ обмена на метаболизм зоны риска и размеры инфаркта миокарда у собак. Кардиология. 2003; 12: 73–8.
17. Pisarenko OI, Tskitishvili OV, Studneva IM, Serebryakova LI. Metabolic effects of ischemic preconditioning and adenosine receptor blockade in dogs. Ann NY Acad Sci 1996; 793: 85–97.
18. Bergmeyer HU. Methods of enzymatic analysis. New York: Academic Press 1974; 3–4: 1464–7, 1696–700, 1704–8, 1772–6, 2101–10, 2127–31.
19. Reimer KA, Hill ML, Jennings RB. Prolonged depletion of ATP and of the adenine nucleotide pool due to delayed resynthesis of adenine nucleotides following reversible myocardial ischemic injury in dogs. J Mol Cell Cardiol 1981; 13: 229–39.
20. Sodi-Pallares D, Testelli M, Fishleder F. Effects of intravenous infusion of potassium-insulin-glucose solution on the electrocardiographic signs of myocardial infarction. Am J Cardiol 1962; 9: 166–81.
21. Opie LH. Glucose and the metabolism of ischaemic myocardium. Lancet 1995; 345: 1520–1.
22. Sidossis LS, Stuart CA, Shulman GI et al. Glucose plus insulin regulate the rate of fatty acid entry into the mitochondria. J Clin Invest 1996; 98: 2244–50.
23. Coleman GM, Gradinac S, Taegtmeyer H et al. Efficacy of metabolic support with glucose-insulin-potassium for left ventricular pump failure after aortocoronary bypass surgery. Circulation 1989; 80: 191–6.
24. Randle PJ. Regulatory interactions between lipids and carbohydrates: The glucose – fatty acid cycle after 35 years. Diabetes Metab Rev 1998; 14: 263–83.
25. Sack MN, Yellon DM. Insulin therapy as an adjunct to reperfusion after acute coronary ischemia. A proposed direct myocardial cell survival effect independent of metabolic modulation. J Am Coll Cardiol 2003; 41 (8): 1404–7.
26. Gao F, Gao E, Yue T-L. Et al. Nitric oxide mediates the antiapoptotic effect of insulin in myocardial ischemia-reperfusion. The roles of PI3-kinase, Akt, and endothelial nitric oxide synthase phosphorylation. Circulation 2002; 105: 1497–506.
27. Rakhit RD, Marberb MS. Nitric oxide: an emerging role in cardioprotection? Heart 2001; 86: 368–72.
28. Engelman RM, Rousou JA, Flack JE 3rd, et al. Reduction of infarct size by systemic amino acid supplementation during reperfusion. J Thorac Cardiovasc Surg 1991; 101 (5): 855–9.
29. Diaz R, Paolasso EA, Piegas LS et al. Metabolic modulation of acute myocardial infarction: The ECLA glucose-insulin-potassium pilot trial. Circulation 1998; 98 (21): 2227–34.
30. Malmberg K, Ryden L, Hamsten A et al. Ettects of insulin treatment on cause-specific one-year mortality and morbidity in diabetic patients with acute myocardial infarction: DIGAMI study group: Diabetes insulin-glucose in acute myocardial infarction. Eur Heart J 1996; 17: 1337–44.