Участие активных форм кислорода в модуляции гипотензивного эффекта динитрозильных комплексов железа

Среди известных доноров оксида азота (NO, нитроксида) в последнее время значительное внимание привлекают низкомолекулярные или связанные с белками комплексы железа. Динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ, общая формула {(RS^-)₂ Fe⁺(NO⁺)2}) являются одной из форм депонирования NO [1]. Однако в крови они распадаются в пределах 1 ч с выделением нитроксида, оказывающего длительное гипотензивное действие [2, 3]. Предполагают, что ДНКЖ разрушаются под действием супероксида и других активных окислителей аналогично мононитрозильным комплексам железа с дитиокарбаматом [4]. Очевидно, что накопление активных форм кислорода (АФК) в крови или сосудистых клетках может оказать существенное влияние на эффективные концентрации NO. В связи с этим первой задачей данной работы было изучение взаимодействия ДНКЖ и АФК в модельных системах in vitro и выяснение влияния АФК на эффекты ДНКЖ на изолированном сосуде.
   Усиленное взаимодействие NO и супероксида, ведущее к образованию пероксинитрита, играет существенную роль в развитии толерантности к нитратам [5]. Однако применение супероксида и пероксида водорода на разных объектах давало неоднозначные результаты: наблюдали как снижение, так и повышение артериального тонуса [5–10]. По этой причине второй задачей работы являлось изучение действия пероксида водорода (H₂O₂) на изолированное сердце и крыс in vivo.
   В свою очередь, усиленное образование NO снижает потребление кислорода митохондриями [11, 12], а следовательно, и образование свободных радикалов кислорода. Это может быть критическим фактором предупреждения реперфузионных повреждений миокарда, когда образование АФК происходит наиболее интенсивно. Показан защитный эффект нитроглицерина, ди- и мононитратов при лечении острого коронарного синдрома, инфаркта миокарда (ИМ) и сердечной недостаточности [13]. В связи с этим еще одной задачей данной работы было выяснение способности внутривенного введения ДНКЖ, наряду со снижением артериального давления (АД), уменьшать необратимые повреждения кардиомиоцитов на модели региональной ишемии и реперфузии миокарда крыс in situ.   

Материалы и методы
   Динитрозильные комплексы синтезировали по разработанному А.Ф.Ваниным способу [3]. Методика измерения ДНКЖ с помощью электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР) была аналогична изложенной в указанной статье. Белковые динитрозильные комплексы получали, добавляя низкомолекулярные ДНКЖ с фосфатными лигандами в растворы альбумина и гемоглобина. Использовали следующие реагенты: аскорбат натрия, тиосульфат натрия, восстановленный L-глутатион, H₂O₂, донор оксида азота PAPA/NONO, ксантин и ксантиноксидазу, супероксиддисмутазу (СОД) и TIRON (все производства “Sigma”), терт-бутил гидропероксид (“Aldrich”), 5-диэтоксифосфорил-5-метил-1-пирролин-N-оксид (“Oxis”).
   Опыты на изолированных полосках аорты крыс проводили в растворе Кребса при 37о. Регистрировали изометрическое напряжение полосок преобразователем UC-2 при предварительном сокращении, вызванном стандартной концентрацией норадреналина (10^-7 М).
   Опыты с введением Н₂О₂ in vivo проводили на самцах крыс Вистар массой 300–350 г, находившихся под кетаминовым наркозом (100 мг/кг). Вводили катетеры в сонную артерию и яремную вену. Регистрировали частоту сердечных сокращений (ЧСС) и среднее АД (ср_АД) при помощи усилителя “BIOGRAPH-4” (Санкт-Петербургский университет аэрокосмического приборостроения) и аналого-цифрового преобразователя “NIUSB 6009” (США). H₂O₂ (0,8%) вводили внутривенно со скоростью 0,4 мл/мин в течение 5 мин дважды с 20-минутным интервалом, в промежутке (10 мин) выполняли контрольное введение физиологического раствора в том же объеме или введение биферментного конъюгата антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в дозе 1,3–1,6 мг/кг. Метод получения биферментного конъюгата описан нами ранее [14], содержание белка в конъюгате составляло 5%, а его специфическая (удельная) активность по СОД – 56 Ед/мг, а по каталазе – 145 Ед/мг препарата.
   Изучение кардиопротекторных свойств ДНКЖ проводили на крысах-самцах Вистар массой 300–450 г, находившимися под кетаминовым наркозом (100 мг/кг веса внутрибрюшинно). Искусственную вентиляцию легких осуществляли комнатным воздухом с добавлением кислорода, с частотой 60–80 в 1 мин, под постоянным контролем кислотно-щелочного баланса (“ABL-30”, “Radiometer”, Копенгаген). Регистрировали давление в сонной артерии (“Мингограф-804”, “Siemens Elema”). Инфаркт миокарда моделировали 40-минутной окклюзией ветви передней нисходящей коронарной артерии и последующей 60-минутной реперфузией по методу Kitakaze и соавт. [15]. В опытной серии непосредственно перед началом региональной ишемии внутривенно болюсом вводили ДНКЖ с цистеиновым лигандом (1:20), растворенный в 0,5 мл физиологического раствора, в дозе 81,6 мг/кг. В предварительных опытах было выяснено, что такая доза ДНКЖ вызывает продолжительное снижение ср_АД, указывающее на вазодилататорный эффект образующегося NO. В контроле перед началом ишемии внутривенно вводили физиологический раствор без ДНКЖ в эквивалентном объеме. В конце опыта в яремную вену вводили болюсом 2% раствор Эванса синего для идентификации интактной зоны левого желудочка (ЛЖ). Гистохимическую локализацию зоны риска (ЗР) и ИМ проводили, окрашивая срезы ЛЖ 2-, 3-, 5-трифенилтетразолий хлоридом. Площади ИМ и ЗР определяли методом компьютерной планиметрии с помощью программы “Imagecal”. В каждой группе рассчитывали (в %) отношение ЗР/масса ЛЖ (ЗР/ЛЖ) и ИМ/ЗР [16].
   Статистическую обработку данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты представлены как M±m.

Результаты
   Образование и стабильность комплексов. Комплексы образуются при смешивании естественных компонентов метаболизма клеток – источников железа и нитросоединений, однако весьма важным является вопрос, могут ли они образовываться в естественных условиях в клетках. В опытах in vitro при наличии источника железа – ферритина, источника NO – GSNO (нитрозоглутатиона) и глутатиона в качестве лиганда происходит образование ДНКЖ, о чем свидетельствовало увеличение сигнала ЭПР (рис. 1). Добавление к среде PAPA/NONO гораздо более эффективного донора NO, чем GSNO, существенно не повлияло на кинетику образования ДНКЖ, что указывает на ионы железа как на наиболее вероятный фактор, лимитирующий в этих условиях скорость формирования ДНКЖ. Супероксид, образуемый при добавлении к смеси ксантина и ксантиноксидазы, практически не влиял на образование ДНКЖ с участием GSNO, но значительно (приблизительно в 3 раза) увеличивал скорость образования ДНКЖ в присутствии PAPA/NONO, т.е. при избытке NO (см. рис. 1).
   В той же среде, но при сниженной скорости образования ДНКЖ из-за очень низкого содержания глутатиона (в 15 раз меньше, чем в среде, соответствующей кривой 1 на рис. 1), добавление к среде энергизированных митохондрий (в присутствии сукцината) как генератора супероксида в 2 раза повышало скорость образования ДНКЖ (рис. 2). В этих условиях добавление антимицина А – ингибитора bc1-сегмента (комплекса III) митохондриальной дыхательной цепи, блокирующего перенос электрона от цитохрома b₅₆₆ на окисленный коэнзим Q и резко усиливающего образование супероксида, на порядок повышало скорость образования ДНКЖ (см. рис. 2).
   В то же время при усиленном образовании АФК при отсутствии доноров нитроксида распад ДНКЖ значительно ускорялся (рис. 3). Особенно быстро распад происходил при наличии в среде хелатора железа ДТПА (см. рис. 3, а). Участие супероксида в разрушении комплексов подтверждается резким замедлением распада при добавлении в указанную среду СОД, нейтрализующей супероксид (см. рис. 3, а и 4, б), или каталазы, нейтрализующей образующийся при дисмутации супероксида H₂O₂ (см. рис. 4, б). Применение ловушки TIRON позволяет проследить за кинетикой снижения уровня супероксида (см. рис. 4, а). Кроме того, распад комплексов в присутствии супероксида может быть значительно замедлен низкомолекулярными антиоксидантами – кверцетином в микромолярных концентрациях (см. рис. 3, б) или аскорбатом в миллимолярных концентрациях (см. рис. 4, б).
   Попавшие в кровоток ДНКЖ быстро связываются с белками, что значительно повышает их устойчивость к аутоокислению (см. рис. 4, б). Однако генерация супероксида тоже усиливала распад комплексов, связанных с гемоглобином или альбумином. Влияние антиоксидантов на устойчивость связанных с белками ДНКЖ оказалось избирательным – аскорбат замедлял распад ДНКЖ, связанных с гемоглобином (рис. 4, б) или альбумином, в то время как кверцетин оказывал подобное действие только на комплексы, связанные с альбумином, но не с гемоглобином. Эти результаты продемонстрировали различия в эффективности антиоксидантов в водной и белковой среде, что предоставляет экспериментатору возможность выбора соответствующего антиоксиданта в зависимости от условий и задачи введения ДНКЖ.
   Действие Н₂О₂. Далее влияние АФК на реализацию эффекта ДНКЖ было изучено на изолированном сосуде, предварительно сокращенном норадреналином. На этом объекте ДНКЖ с цистеином (1:2) вызывали зависимое от дозы расслабление, имевшее двухфазный характер (рис. 5). Добавление Н₂О₂ (100 мкМ) повышало исходный тонус сосуда, на этом фоне эффект тех же доз ДНКЖ был ослаблен и значительно укорочен. При добавлении к исходному раствору СОД (25 Ед/мл) – фермента, трансформирующего нативный супероксид в Н₂О₂, продолжительность вазодилататорного ответа увеличивалась, а скорость восстановления тонуса снижалась примерно в 2 раза. Сочетание СОД и каталазы еще больше удлиняло время гипотензивного эффекта.
   В связи со способностью Н₂О₂ изменять тонус сосуда и модулировать эффект ДНКЖ, действие Н₂О₂ в широком диапазоне концентраций было испытано на изолированном сердце, работавшем в изоволюмическом режиме. Низкие концентрации H₂O₂ (до 100 мкМ) снижали тонус коронарных артерий, степень снижения зависела не только от концентрации, но и от исходного ср_АД. При повышенном ср_АД (около 100 мм рт. ст.) введение H₂O₂ снижало ср_АД примерно на 20 мм рт. ст, в то время как при низком ср_АД (55 мм рт. ст.) оно снижалось всего на 5 мм рт. ст. Более высокие концентрации Н₂О₂ – выше 200 мкМ – всегда повышали ср_АД.
   Первое введение Н₂О₂ наркотизированным крысам вызывало двухфазную реакцию ср_АД (рис. 6). Повышение ср_АД в первой фазе происходило при неизменной ЧСС. Второе введение Н₂О₂ вызывало быстрое и глубокое снижение ср_АД, останавливавшееся только с прекращением введения H₂O₂ (рис. 6). Восстановление ср_АД происходило медленно, и исходный уровень не достигался даже через 40 мин. Промежуточное введение физраствора не оказывало влияния на ср_АД, а введение конъюгата СОД и каталазы значительно уменьшало величину и длительность последующего гипотензивного эффекта Н₂О₂.
   Ишемия и реперфузия миокарда in vivo. В исходном состоянии ср_АД составляло 95±7 мм рт. ст., а ЧСС – 225±7 уд/мин^-1. Введение ДНКЖ наркотизированным животным сопровождалось быстрым и глубоким снижением ср_АД, начинавшимся через 14±1 с и достигавшим минимального значения (57±4 мм рт. ст.) через 36±4 с (рис. 7). Далее происходило довольно быстрое повышение ср_АД, и уже через 2 мин оно достигало 87±3 мм рт. ст. Вторая фаза снижения ср_АД начиналась через 5 мин, и к концу ишемии, а также в период реперфузии ср_АД оставалось достоверно ниже, чем в контроле. В большинстве случаев (кроме двух) у животных после введения ДНКЖ снижению ср_АД предшествовала другая кратковременная (длительностью 1–4 с) реакция – повышение ср_АД на 8–20 мм рт. ст. с одновременным снижением ЧСС в среднем на 10%. В контрольной группе введение физиологического раствора не повлияло на ср_АД и ЧСС. В обеих группах на 8–15-й мин региональной ишемии наблюдались нарушения сердечного ритма. Их длительность была существенно меньше на фоне введения ДНКЖ и составила в среднем 170±10 против 445±30 с в контроле (p<0,001).
   Морфометрический анализ срезов ЛЖ после реперфузии не выявил отличий в ЗР между группами (см. таблицу). Однако размер ИМ был достоверно меньше в группе животных, получивших ДНКЖ непосредственно перед наложением лигатуры. Таким образом, использованная доза ДНКЖ, оказывавшая обычное вазодилататорное действие, достоверно уменьшала и риск развития аритмии, и реперфузионное повреждение миокарда. 

Обсуждение
   Полученные результаты свидетельствуют о том, что действие АФК на эффект ДНКЖ является неоднозначным. Супероксид выступает не только как необходимый элемент образования ДНКЖ, но и как его регулятор. С одной стороны, супероксид, генерируемый ксантиноксидазой либо энергизованными митохондриями, стимулирует образование ДНКЖ, особенно при высокой концентрации свободного нитроксида. Поскольку указанные компоненты являются естественными метаболитами, полученный результат означает, что ДНКЖ могут образовываться в клетках при умеренном окислительном стрессе и, тем самым, формировать собственный внутриклеточный пул NO. Эти данные согласуются с концепцией А.Ф.Ванина [1, 4], рассматривающего ДНКЖ как форму запасания NO в клетках. Преимущество ДНКЖ перед NO в этом плане, очевидно, состоит в увеличении длительности эффекта, поскольку NO представляет собой молекулу с кратким периодом жизни (3 с). В процессе образования ДНКЖ в клетках, по-видимому, участвует и стимулируемое супероксидом высвобождение ионов железа из его внутриклеточных депо [17]. С другой стороны, вполне вероятно, что наряду с синтезом ДНКЖ происходит их деструкция под действием O-2, проявляющаяся особенно при низком уровне NO. Из этого следует, что для образования ДНКЖ необходим определенный баланс между интенсивностью генерации супероксида, содержанием NO и “свободного” железа.
   Образующиеся в крови ДНКЖ легко связываются с белками, что сильно замедляет выход нитроксида и обеспечивает длительное вазодилататорное действие in vivo [2, 3]. Наличие подобного эффекта на изолированном сосуде или сердце позволяет предположить, что при отсутствии белков плазмы ДНКЖ могут связываться и с белками эндотелиальных клеток или/и действующим началом могут быть соединения, находящиеся в динамическом равновесии с ДНКЖ, в частности нитрозотиолы. Как показали наши данные, длительность жизни ДНКЖ в крови в высокой степени зависит от уровня АФК. Низкомолекулярные антиоксиданты – флавоноиды, аскорбат, а также антиоксидантные ферменты замедляют распад ДНКЖ и пролонгируют их вазодилататорный эффект, а H₂O₂ укорачивает его. Таким образом, концентрация высоко- и низкомолекулярных динитрозильных комплексов железа может регулироваться АФК и, в свою очередь, влиять на них.
   Действие H₂O₂ на сосудистый тонус оказалось сложным. Он уменьшал сосудорасширяющий эффект ДНКЖ на изолированном сосуде, но повышал исходный тонус. Это согласуется с наличием повышенного уровня пероксида в крови у крыс с гипертонией, индуцированной большим потреблением соли [18], и у больных артериальной гипертонией, причем между концентрацией пероксида и уровнем АД существует положительная корреляция [19]. В опытах на изолированном сердце он в умеренных концентрациях, как правило, оказывал гипотензивное действие, которое было в прямой зависимости от исходного уровеня ср_АД. Данный эффект реализуется через высвобождение нитроксида, и блокада образования последнего сочетается с ухудшением сократительной функции сердца в условиях окислительного стресса [8]. Однако снижение тонуса коронарных артерий под влиянием H₂O₂ происходило плавно и достигало пикового значения примерно через 10 мин, после чего развивалось еще более медленное восстановление. Такая динамика отличается от действия нитратов или ДНКЖ. Возможно, что в данной ситуации, когда из-за высокой скорости перфузии сердца образование нитроксида и так уже близко к максимуму [20, 21], включается другой механизм – образование зависимого от эндотелия гиперполяризующего фактора. Показано, что H₂O₂, образующийся в эндотелиальных клетках, вызывает расслабление гладкомышечных клеток, связанное с открытием зависимых от Са²⁺ К+-каналов [22].
   Еще более сложным оказывается эффект H₂O₂ в опытах in vivo. Разница между первым и вторым введением Н₂О₂ может быть связана с симпатической активацией, возникающей при первом введении и сопровождающейся подъемом ср_АД и ЧСС [6]. Снижение ср_АД при втором введении можно объяснить активацией эндотелиальной NO-синтазы [7]. Вместе с тем динамика ср_АД при втором введении напоминала действие ДНКЖ [3]. Применение антиоксидантных ферментов значительно уменьшало эффект. Аналогичным наблюдавшемуся в наших опытах эффектом обладает FeSOD, преобразующий нативный супероксид в пероксид [10].
   Способность ДНКЖ взаимодействовать с супероксидом и, тем самым, снижать окислительный стресс послужила одной из причин применения ДНКЖ при ишемии и реперфузии сердца, когда процесс образования АФК значительно усиливается. Введение ДНКЖ снижало частоту нарушений ритма во время региональной ишемии и значительно уменьшало размеры ИМ при реперфузии у крыс in vivo. Ранее в клинических исследованиях было показано, что внутривенное введение нитратов снижает размеры ИМ и смертность пациентов с острым коронарным синдромом [23, 24]. Цитопротекторные свойства доноров NO – L-аргинина и SPM-5185 (нитропроизводного цистеина) – были изучены при проведении кардиохирургических операций [25, 26]. Включение этих соединений в состав раствора для кровяной кардиоплегии ограничивало размеры ИМ и улучшало восстановление сократительной функции сердца.
   Уменьшение ишемического и реперфузионного повреждения сердца под действием фармакологических доноров NO может быть обусловлено комплексом защитных механизмов. Во-первых, NO способен обратимо ингибировать цитохромоксидазу (комплекс IV дыхательной цепи) и, тем самым, снижать поглощение кислорода [11, 12]. Во-вторых, стимуляция NO растворимой гуанилатциклазы, сопровождающаяся образованием цГМФ, снижает Са²⁺ ток L-типа и уменьшает концентрацию цАМФ [27]. В-третьих, введение ДНКЖ сопровождалось значительным снижением ср_АД, что уменьшало нагрузку на сердце. Все эти механизмы снижают потребление кислорода и потребность в энергии ишемизированных миоцитов, что является физиологически значимым во время ишемии и ранней реперфузии [12, 28]. В-четвертых, недавно было показано, что NO, вызывая деполяризацию внутренней митохондриальной мембраны, способен уменьшать повреждения кардиомиоцитов благодаря снижению перегрузки митохондрий ионами Са²⁺ [29]. Эти данные свидетельствуют о том, что NO способен воздействовать на критический компонент ишемического-реперфузионного повреждения миокарда – дисбаланс между сниженным производством энергии и ее потреблением в ишемизированных кардиомиоцитах. Наконец, митохондрии способны регенерировать NO из продуктов окисления ДНКЖ (вероятнее всего, из нитрита), что может повышать концентрацию NO в зоне ишемического поражения и способствовать восстановлению кровотока.
   Гибель миоцитов при реперфузии может быть вызвана не только их некрозом, но и активацией их запрограммированной смерти – апоптоза. Известны несколько механизмов, посредством которых NO ингибирует апоптоз миоцитов. Один из них обусловлен S-нитрозилированием каспаз-1 и -3, приводящим к снижению их активности, другой сопряжен с образованием цГМФ и сопутствующим уменьшением перегрузки миоцитов Са²⁺, опосредующей апоптоз, третий включает индукцию цитопротекторных белков теплового шока (HSP 70 и 32) [13]. Таким образом, образующийся из ДНКЖ нитроксид способен блокировать оба основных пути гибели клеток.
   Защитный эффект ДНКЖ при реперфузии может также быть связан с другими компонентами комплекса. Благодаря наличию сульфгидрильной (-SH) группы в структуре цистеина этот компонент ДНКЖ способен проявлять антиоксидантные свойства и уменьшать ишемическое и реперфузионное повреждение сердца [30]. Кроме того, входящий в состав ДНКЖ полисахарид декстран при реперфузии может восполнять функцию белков плазмы, поддерживая осмотическое давление в интерстиции, и, тем самым, предохранять ишемизированные кардиомиоциты от осмотического шока [31]. Вклад каждого из них в уменьшении гибели клеток от ишемии и реперфузии предстоит выяснить в дальнейшем.
   

Литература
1. Vanin AF, Stukan RA, Manukhina EB. Physical properties of dinitrosyl iron complexes in relation with their vasodilator activity. Biochim Biophys Acta 1996; 1295: 5–12.
2. Галаган М.Е., Орановская Е.В., Мордвинцев П.И. и др. Гипотензивный эффект динитрозильных комплексов железа на бодрствующих животных. Бюл. ВКНЦ 1988; 2: 75-80.
3. Лакомкин В.Л., Тимошин А.А., Ванин А.Ф. и др. Длительный гипотензивный эффект стабильных динитрозильных комплексов железа у бодрствующих нормотензивных и гипертензивных крыс. Кардиологич. вестн. 2006; 1 (1): 42–7.
4. Vanin AF, Huisman A, Stroes ESG et al. Antioxidant capasity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping. Free Radic Biol Med 2001; 30 (8): 813–24
5. Hanspal IS, Magid KS, Webb DJ, Megson IL. The effect of oxidative stress on endothelium-dependent and nitric oxide donor-induced relaxation: implications for nitrate tolerance. Nitric Oxide 2002; 6 (3): 263–70.
6. Huang HS, Stahl GL, Longhurst JC. Cardiac-cardiovascular reflexes induced by hydrogen peroxide in cats. Am J Physiol 1995; 268 (5 Pt 2): H₂114–24.
7. Bharadwaj L, Prasad K. Mediation of H₂O₂-induced vascular relaxation by endothelium-derived relaxing factor. Mol Cell Biochem 1995; 149–150: 267–70.
8. Valen G, Skjelbakken T, Vaage J. The role of nitric oxide in the cardiac effects of hydrogen peroxide. Mol Cell Biochem 1996; 159 (1): 7–14.
9. Bryan RM Jr, Steenberg ML, Marrelli SP. Role of endothelium in shear stress-induced constrictions in rat middle cerebral artery. Stroke 2001; 32: 1394–400.
10. Aleksic T, Jovovic D, Miloradovic Z, et al. The effects of iron-containing superoxide dismutases on haemodynamic parameters in spontaneously hypertensive rats. Acta Physiol Hung 2006; 93 (4): 285–92.
11. Clementi E, Brown GC, Foxwell N, Moncada S. On the mechanism by which vascular endothelial cells regulate their oxygen consumption. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96 (4): 1559–62.
12. Loke KE, McConnell PI, Tuzman JM et al. Endogenous endothelial nitric oxide synthase-derived nitric oxide is a physiological regulator of myocardial oxygen consumption. Circ Res 1999; 84 (7): 840–5.
13. Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev 1991; 43: 109–42.
14. Максименко А.В., Тищенко Е.Г. Модификация каталазы хондроитинсульфатом. Биохимия 1997; 62 (10): 1364–8.
15. Kitakaze M, Takashima S, Funaya H et al. Temporary acidosis during reperfusion limits myocardial infarct size. Am J Physiol 1997; 272: H2071–8.
16. Писаренко О.И., Студнева И.М., Серебрякова Л.И. и др. Защита миокарда крыс селективным ингибитором Na+/H+ обмена и ишемическим прекондиционированием. Кардиология 2005; 45 (2): 37–44.
17. Biemond P, Swaak AJ, Van Eijk HG, Koster JF. Superoxide dependet iron release from ferritin in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med 1988; 4: 185–98.
18. Swei A, Lacy F, DeLano FA, Schmid-Schonbein GW. Oxidative stress in the Dahl hypertensive rat. Hypertension 1997; 30 (6): 1628–33.
19. Lacy F, O'Connor DT, Schmid-Schonbein GW. Plasma hydrogen peroxide production in hypertensives and normotensive subjects at genetic risk of hypertension. J Hypertens 1998; 16 (3): 291–303.
20. Kuo L, Chilian WM, Davis MJ. Interaction of pressure- and flow-induced responses in porcine coronary resistance vessels. Am J Physiol 1991; 261: H1706–15.
21. Miura H, Bosnjak JJ, Ning G et al. Role for hydrogen peroxide in flow-induced dilation of human coronary arterioles. Circ Res 2003; 92: e31–e40.
22. Matoba T, Shimokawa H, Nakashima M et al. Hydrogen peroxide is an endothelium-derived hyperpolarizing factor in mice. J Clin Invest 2000; 106: 1521–30.
23. Yusuf S, Collins R, MacMahon S et al. Effect of intravenous nitrates on mortality in acute myocardial infarction: an overview of the randomized trials. Lancet 1988; i: 1088–92.
24. European Study of Prevention of Infarct with Molsidomine (ESPRIM) Group. The ESPRIM trial: short-term treatment of acute myocardial infarction with molsidomine. Lancet 1994; 344: 91–7.
25. Sato H, Zhao ZQ, McGee DS, et al. Supplemental L-arginine during cardioplegic arrest and reperfusion avoids regional postischaemic injury. J Thorac Cardiovasc Surg 1995; 110: 302–14.
26. Nakanishi K, Zhao ZQ, Vinten-Johansen J et al. Blood cardioplegia enhanced with nitric oxide donor SPM-5185 counteracts postischemic endothelial and ventricular dysfunction. J Thorac Cardiovasc Surg 1995; 109: 1146–54.
27. Vinten-Johansen J, Zhao ZQ, Nakamura M et al. Nitric oxide and the vascular endothelium in myocardial ischemia-reperfusion injury. Ann NY Acad Sci 1999; 874: 354–70.
28. Brady AJB, Warren JB, Poole-Wilson PA et al. Nitric oxide attenuates cardiac myocyte contraction. Am J Physiol 1993; 265: H176–82.
29. Rakhit RD, Mojet MH, Marber MS et al. Mitochondria as targets for nitric oxide-induced protection during simulated ischemia and reoxygenation in isolated neonatal cardiomyocytes. Circulation 2001; 103: 2617–23.
30. Genet S, Kale RK, Baguer NZ. Effects of free radicals on cytosilic creatine kinase activities and protection by antioxidant enzymes and sulfhydryl compounds. Mol Cell Biochem 2000; 210 (1–2): 23–8.
31. Levitsky S, Mullin ED, Sloane RE et al. Effects of a hyperosmotic perfusate on extended preservation of the heart. Circulation 1971; 43: I–124–I–129.