Регуляторные эффекты взаимодействия гликозаминогликанов углеводной выстилки люминальной сосудистой поверхности с низко- и высокомолекулярными лигандами

Данные современных исследований свидетельствуют о многоплановой роли гликозаминогликанового компонента гликокаликса, экстрацеллюлярного матрикса и интерстиция в организме. Имеющиеся сведения не позволяют видеть в углеводном покрытии только гидратированную подложку для клеточного удержания и организации пути их передвижения. Важно ее участие в построении тканей, обеспечении существования околоклеточной оболочки, функционирование в процессах передачи сигнала в клетку. Такая ситуация обусловливает развитие гликозаминогликановых исследований по многим направлениям с участием специалистов разных областей знания.
   Обнаружение молекулярных партнеров, взаимодействующих с гликозаминогликанами, – гиалоадгеринов, синтаз, гиалуронидаз, других ферментов и ингибиторов их метаболизма расширяет сферу изучения и увеличивает число его объектов. Значимость таких исследований подчеркивается влиянием гликозаминогликанов на процессы морфогенеза, эмбриогенеза, интерстициального гомеостаза и клеточного поведения.
   Связывание низкомолекулярных веществ. К белковой основе/кору протеогликанов ковалентно присоединены линейные гликозаминогликановые цепи разной степени сульфатирования. Анализ протеогликанового состава версикана нормальной и атеросклеротически пораженной стенки артерий обнаружил его гетерогенность [1]. Отрицательный заряд сульфогрупп влияет на участие ионов, пространственного осмотического градиента, объема гидратации в функционировании фибриллярной сети, внеклеточного гелевого матрикса как биологического сита в процессах клеточной пролиферации, адгезии, подвижности, коагуляции крови. В норме (регулируя, в частности, тромбиновую активность) интерстиций живых тканей поддерживается в относительно дегидратированном состоянии. Механизм этой поддержки сложен и зависит от гликозаминогликанов. В патологических условиях (воспаление и др.) возбужденные ткани (включая артериальные) разбухают, препятствуя тканевому потоку/перфузии, затрудняя проникновение нутриентов и лекарственных средств. Ферментативное удаление из внеклеточной гелевой оболочки гликозаминогликанов снижает набухание тканей и способствует в результате такого частичного дегидратирования регуляции скорости важных биологических реакций. В целом, гидратационный объем гелевого матрикса поддерживается балансом сил, включающих эластичность разных полимерных компонентов, их химическую аффинность, фиксированный заряд, осмотические взаимодействия ионизованного растворителя.
   Предположительно, макромолекулярные взаимодействия, определяющие развитие атерогенеза, должны быть направлены, в частности, на относительно дегидратационное состояние интерстиция, превалирующее в норме in vivo. Поскольку эти силы внутренне сопряжены с механическими и структурными факторами, соответствующими количеству и пространственному распределению гликозаминогликанов в интактных тканях, то изменения в составе и распределении гликозаминогликанов будут влиять на объем гидратации. Действительно, гистологически обнаруженные нарушения в атеросклеротических тканях, такие как диффузионное утолщение и дезорганизация фибриллярных элементов в интиме, указывают на дисрегуляцию локального водного гомеостаза. Было установлено, что в сравнении с нормальной у атеросклеротически пораженной (IV тип поражения, согласно классификации Американской ассоциации сердца) ткани аорты наблюдается уменьшение степени сульфатирования хондроитинсульфата [1]. Из-за этого снижается антикоагулянтный резерв экстрацеллюлярного матрикса, так как связывание антитромбина с хондроитинсульфатом затрудняется необходимостью дегидратации – удаления большего количества молекул воды с белковой поверхности (в реакции последовательного ингибирования фактора Xa). Пространственное расположение гликозаминогликановых цепей может заполнять экстрацеллюлярный матрикс и способствовать белок-белковому взаимодействию простым сокращением эффективного объема доступного для диффузии. Однако варьирование степени сульфатирования гликозаминогликанов может влиять на баланс воды в экстрацеллюлярном матриксе изменением количества растворителя, способного обильно гидратировать белковую поверхность [2]. Так, косольвент (дополнительно растворенное в системе вещество) принуждает белки к частичной дегидратации (благодаря собственной гидратации) и сдвигает равновесие в сторону меньшего содержания связанной воды в гидратационном слое белков. Это является следствием термодинамической стабильности и связи между связыванием воды и образованием белковых комплексов, которое и направляет равновесие к кажущемуся повышению аффинности белок-белкового взаимодействия [2]. Вместе с тем разработка новых антикоагулянтов на основе пентасахарида из гепариновой последовательности показала, что увеличение степени сульфатирования последней ведет к усилению ее аффинности к антитромбину (без учета влияния гидратации) и повышению времени полужизни в кровотоке [3]. Вероятно, для надежного выяснения роли переноса воды в рассматриваемой ситуации необходимы исследования других реакций коагуляционного каскада [2], а также пара- и трансцеллюлярного (посредством аквапоринов) транспорта воды [4].

   Связывание высокомолекулярных веществ. Гликозаминогликаны являются антеннами клеточной поверхности для связывания с хемокинами [5]. С одной стороны, повышение локальной концентрации хемокинов на клетке вблизи рецептора способствует их взаимодействию (передающему сигнал на клеточный G-белок в цитозоле), когда хемокин может переходить с поверхностного гликозаминогликана на рецептор, с другой – комплекс хемокина с растворимым гликозаминогликаном не способен связываться с рецептором. Так, гликозаминогликаны могут регулировать взаимодействие рецепторов с хемокинами, концентрируя последние на поверхности клеток и создавая конкуренцию за хемокин между клеточным рецептором и растворимым гликозаминогликаном [5]. Образованием депо макромолекулярных лигандов, связанных с поверхностными клеточными гликозаминогликанами, удается не только регулировать биологическую активность, но и защищать лиганды от инактивации, например, предотвращая неферментативное гликозилирование основного фактора роста фибробластов благодаря связыванию с гепарансульфатом (но не с хондроитинсульфатом) [6]. Связывание с белками позволяет протеогликанам участвовать в нормальных условиях в клеточном и тканевом развитии.
   При патофизиологических условиях содержащие хондроитинсульфат/гепарансульфат протеогликаны (бигликан, версикан, пеоликан и др.) могут инициировать повышенное связывание (в интактном и окисленном виде) липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и образовывать внеклеточные преатеромные липидные отложения в интиме и внутри медии. Такое заякорирование ЛПНП может сопровождаться образованием тройного комплекса протеогликан/липопротеины/Ca²⁺, ведущим к кальцификации артерий [7]. Отмечалось, что хондроитинсульфат протеогликан макрофагов связывает окисленные ЛПНП. В условиях окислительного стресса содержание этого протеогликана на макрофагах увеличивается, что наряду с захватом ЛПНП может ускорять развитие атеросклероза [8]. Кроме того, экзогенно введенные гепарансульфат или хондроитинсульфат могут встраиваться в клеточное окружение, увеличивая захват окисленных ЛПНП [9]. Было показано, что гликозаминогликаны (гепарансульфат, хондроитинсульфат) ускоряют активацию плазминогена урокиназой, влияя на k-KAT, а ЛПНП или липопротеин(a) ингибируют их эффект [10]. Это подчеркивает многоплановость опосредованной регуляторной функции гликозаминогликанов.
   Таким образом, гликозаминогликаны, представленные в гликокаликсе, экстрацеллюлярном матриксе, интерстиции, участвуют в связывании биомакромолекул разного типа, действуя на них аллостерически и мостиковым или подложковым образом. Предполагалось, что в зависимости от структуры и состава протеогликанов (последовательность сахаров, вид белка) они могут индивидуализировать свои функции в организме [11].
   Центры взаимодействия на гликозаминогликанах. Результатом многочисленных исследований стало обнаружение уникальной пентасахаридной последовательности (см. рисунок) в гепарине [12], которая опосредует низкоаффинное связывание гликозаминогликана с антитромбином. Происходящие при этом с последним конформационные изменения усиливают их связывание. Оно способствует образованию тройного комплекса антитромбин–гепарин–протеаза (тромбин или фактор Ха), в котором осуществляется возвращение к низкоаффинному связыванию углевода с белком, опосредуя специфическое взаимодействие ингибитора с ферментом на углеводной подложке или матрице. Полученные данные позволяют использовать синтетические аналоги связывающей антитромбин пентасахаридной последовательности гепарина в качестве антикоагулянтов для лечения венозных тромбоэмболий [3]. Связывающие гепарин центры белков характеризуются наличием кластеров положительно заряженных основных аминокислот (аргинин или лизин – Arg или Lys соответственно), которые образуют ионные пары с пространственно ориентированными отрицательно заряженными сульфо- и карбоксильными группами гликозаминогликановой цепи. Аминокислотные последовательности связывающих гепарин центров были определены в витронектине, аполипопротеинах В и Е, 4-м тромбоцитарном факторе [12]. Они представлены в виде двух мотивов, характерных участков аминокислотной последовательности белков, – ХВВХВХ и ХВВВХХВХ, где В – остаток основной, а Х – отрицательно незаряженной аминокислоты (наиболее часто серин или глицин – Ser или Gly соответственно; см. рисунок). Первый мотив организуется в b-слой, а второй сворачивается в a-спираль. Из двух a-спиральных и двух антипараллельных b-слоев вокруг гидрофобного ядра состоит лектиновый модуль С-типа, осуществляющий связывание гиалуронана [13]. Хотя одного связывающего модуля достаточно для взаимодействия с гиалуронаном (TSG-6), некоторые белки имеют их по два (белки в протеогликанах – агрекане, версикане, нейрокане). Рецептор опосредованной гиалуронаном подвижности (RHAMM) имеет другой мотив связывания гиалуронана ВХ7В [13]. Отмечалось, что гексасахаридная последовательность дерматансульфата может способствовать связыванию гепаринового кофактора II и аллостерическим образом вызывать затем селективную инактивацию тромбина [14]. Ингибированию поддается тромбин в растворе и связанный с фибрином или с поверхностью пораженного сосуда.
   Приведенные результаты избирательного взаимодействия белков с гликозаминогликанами выявляют роль связывающих гликозаминогликан доменов в сосудистой биологии и открывают перспективы для разработки фармакологического контроля процессов, протекающих в сосудистой стенке.
   Эффекты целых и фрагментированных гликозаминогликанов. Известны антикоагулянтные свойства гликозаминогликанов, проявляемые ими в поли- и олигомерном виде, начиная с некоторого порогового значения молекулярной массы производного [14, 15]. Следует отметить, что биологические эффекты гиалуронана заметно варьируют в зависимости от его молекулярной массы. Так, высокомолекулярные гиалуронановые полисахариды, как молекулы пространственного наполнения и гидратации тканей, являются ангиогенными, противовоспалительными и иммуносупрессивными [16]. Фрагменты гиалуронана с молекулярной массой 20 кДа уже стимулируют синтез воспалительных цитокинов. Меньшие фрагменты (6–20 кДа) гиалуроновой кислоты оказываются ангиогенными, провоспалительными и иммуностимулирующими [13, 16]. Гиалуронановые фрагменты с молекулярной массой 200 кДа улучшают in vitro выживание эозинофилов периферической крови, а гиалуроновая кислота (молекулярная масса – от 3000 до 6000 кДа) имеет существенно меньший эффект [13]. Фрагменты гиалуронана могут обладать биологической активностью, отличной от полимерной формы. Низко-, но не высокомолекулярный гиалуронан стимулирует продукцию металлоэластазы в клетках МН-S и экспрессию индуцибельной NO-синтазы в эндотелиальных и купферовских клетках печени крыс [13]. Связывание высокомолекулярной гиалуроновой кислоты с CD44 ингибируется ее олигосахаридными фрагментами, состоящими из 6–18 сахаров. Это подчеркивает то, что именно гексамер гиалуронана занимает лимитирующий участок связывающего центра белка. С увеличением длины цепи гиалуронана (20–30 сахаров) степень ингибирования повышается [13]. Механизм зависимости эффектов от молекулярной массы гиалуронановых производных пока неизвестен. Необходимо особо отметить зависимость экспериментальных данных от количества используемого гиалуронана [17], применяемых лотов гиалуроновой кислоты (имеющих различия в зависимости от производителей) [13]. Поэтому следует весьма внимательно и осторожно подходить к интерпретации таких данных, включая некоторые контрольные эксперименты с гиалуронаном и сульфатированными гликозаминогликанами.
   

Литература
1. McGee M, Wagner WD. Chondroitin sulfate anticoagulant activity is linked to water transfer: relevance to proteoglycan structure in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23 (10): 1921–7.
2. Di Cera E. Atherosclerosis: testing the water. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23 (10): 1713–4.
3. Weitz JI. New anticoagulants for treatment of venous thromboembolism. Circulation 2004; 110 (9 Suppl. 1): I19–26.
4. Kuschert GSV, Coulin F, Power CA et al. Glycosaminoglycans interact selectively with chemokines and modulate receptor binding and cellular responses. Biochemistry 1999; 38 (39): 12959–68.
5. Nissen NN, Shankar R, Gamelli RL et al. Heparin and heparan sulphate protect basic fibroblast growth factor from non-enzymic glycosylation. Biochem J 1999; 338 (Pt 3): 637–42.
6. Siegel G, Malmsten M, Klussendorf D, Leonhardt W. Physicochemical binding properties of the proteoglycan receptor for serum lipoproteins. Atherosclerosis 1999; 144 (1): 59–67.
7. Kaplan M, Aviram M. Macrophage plasma membrane chondroitin sulfate proteoglycan binds oxidized low-density lipoprotein. Atherosclerosis 2000; 149 (1): 5–17.
8. Kaplan M, Williams KJ, Mandel H, Aviram M. Role of macrophage glycosaminoglycans in the cellular catabolism of oxidized LDL by macrophages. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998; 18 (4): 542–53.
9. Edelberg JM, Weissler M, Pizzo SV. Kinetic analysis of the effects of glycosaminoglycans and lipoproteins on urokinase-mediated plasminogen activation. Biochem J 1991; 276 (Pt 3): 785–91.
10. David G, Danneels A, Duerr J et al. Heparan sulfate proteoglycans. Essential co-factors in receptor-mediated processes with relevance to the biology of the vascular wall. Atherosclerosis 1995; 118 (Suppl.): S57–67.
11. Munoz EM, Linhardt RJ. Heparin-binding domains in vascular biology. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24 (9): 1549–57.
12. Nenci GG. Dermatan sulphate as an antithrombotic drug. Pathophysiol Haemost Thromb 2002; 32 (5–6): 303–7.
13. Bianchini P. Therapeutic potential of non-heparin glycosaminoglycans of natural origin. Semin Thromb Hemost 1989; 15 (4): 365–9.
14. Mehta D, Malik AB. Signaling mechanisms regulating endothelial permeability. Physiol Rev 2006; 86 (1): 279–367.
15. Camenisch TD, McDonald JA. Hyaluronan: is bigger better? Am J Respir Cell Mol Biol 2000; 23 (4): 431–3.
16. Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? Glycobiology 2003; 13 (12): 105R–15R.
17. Tammi MI, Day AJ, Turley EA. Hyaluronan and homeostasis: a balancing act. J Biol Chem 2002; 277 (7): 4581–4.