начало :: поиск :: подписка :: издатели :: карта сайта

 

---

Том 08/N 1/2006

ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ

---

Субпопуляции трансплантируемых стволовых кроветворных клеток

---

Л.Ю. Гривцова, Н.Н. Тупицын

ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

---

Основным способом преодоления тяжелых лекарственных цитопений и неотъемлемой частью современных химиотерапевтических протоколов при различных онкологических заболеваниях, особенно при гемобластозах, является трансплантация стволовых кроветворных клеток. Цель процедуры – это максимально быстрое и полное восстановление кроветворения, поврежденного высокими дозами цитостатических препаратов.
   Основой для использования стволовых кроветворных клеток в условиях клиники послужили результаты длительных многочисленных фундаментальных исследований. Впервые восстановление кроветворения у смертельно облученных животных из экранированной бедренной кости продемонстрировано L.O. Jacobson и соавт. в 1950 г. [1], а в 1952 г. E. Lorenz и соавт. [2] показали, что восстановление кроветворения возможно и при внутривенной инфузии клеток костного мозга. Таким образом, была экспериментально подтверждена гипотеза русского военного врача А.А. Максимова о циркуляции в периферическом русле кровяных клеток, способных мигрировать из костного мозга и при необходимости восполнять кроветворение [3].
   Термин “стволовая кроветворная клетка” (СКК) в экспериментальной гематологии появился в работах американских ученых J.W. Goodman и G. Hodgson в 1962 г. [4]. Тогда же был разработан и применен в эксперименте метод клонирования кроветворных клеток в селезенке смертельно облученных мышей [5]. Дальнейшие эксперименты установили способность стволовых кроветворных клеток/клеток-предшественниц гемопоэза формировать в организме или культуре колонии-клоны, возникающие из одной клонообразующей клетки, эти клетки были названы колониеобразующими единицами (КОЕ) [6].
   Благодаря развитию методов клонирования гемопоэтических клеток-предшественниц не только in vivo, но и ех vivo стало возможным глубокое изучение клеток данного отдела гемопоэза, показана неоднородность пула стволовых кроветворных клеток. В 70-е годы были охарактеризованы полипотентные СКК, способные к самоподдержанию, обеспечивающие стойкое, длительное восстановление гемопоэза. Эти клетки имели высокий потенциал пролиферации и были способны к дифференцировке по всем направлениям гемопоэза [7, 8].
   Экспериментально было установлено, что существуют разные типы СКК, сходных морфологически, но различающихся по уровням дифференцировки, пролиферативному потенциалу и способностью к восстановлению. В итоге сформировалась относительно четкая иерархическая система, характеризующая последовательность клеточных дифференцировок на ранних этапах кроветворения [9].
   Длительное время в качестве источника стволовых кроветворных клеток использовался эксфузионный костный мозг. Первая успешная трансплантация (аллогенная трансплантация клеток костного мозга) была выполнена в США ребенку, страдавшему тяжелой формой иммунодефицита, в 1968 г. С тех пор и до середины 90-х годов прошлого столетия значительную долю трансплантаций кроветворной ткани составляли ауто- и аллотрансплантации клеток костного мозга. Несмотря на значительные клинические успехи, метод имел ряд серьезных ограничений. С конца 90-х годов, когда был подтвержден феномен “мобилизации”, т. е. выход СКК в периферическое русло под влиянием колониестимулирующих факторов и/или химиотерапии, а также отработаны протоколы стимуляции кроветворения, основным источником СКК становится периферическая кровь.
   В настоящее время ежегодно проводятся тысячи аутологичных и аллогенных трансплантаций кроветворной ткани, и большинство из них – это трансплантации “мобилизованных” или, иначе, периферических стволовых клеток крови (ПСКK). Фракцию мононуклеарных клеток крови, обогащенную CКК, получают в ходе процедуры цитафереза, который при необходимости можно неоднократно повторять.
   Одной из самых серьезных проблем при трансплантации кроветворной ткани является вопрос качества трансплантата, т. е. способность кроветворных клеток полноценно восстановить кроветворение.
   Длительное время оценку качества гемопоэтического материала проводили на основании определения роста различных типов клеточных колоний в полужидких культуральных системах [10,11]. Однако отсутствие единых стандартов теста из-за многообразия реактивов, а также отсроченность в получении результатов делали метод колониеобразования не совсем удобным для клинического применения.
   Существовала также проблема определения момента начала проведения процедур цитафереза. Гематологические показатели крови не всегда отражали реальный выброс СКК в периферическое русло, и часто требовалось проведение более 3 процедур. Эти проблемы были решены с открытием антигена CD34 [12]. Молекула CD34 является стадиеспецифичным антигеном, определяющим клетки ранних этапов дифференцировки, спектр ее экспрессии и структура в настоящее время детально описаны [13], а функции CD34-антигена и возможности применения пула стволовых клеток для клиники стали предметом детального изучения во всем мире [14, 15].
   Именно минорная популяция CD34+-клеток в последние годы была объектом детального изучения. Показано, что при достаточной морфологической однородности CD34+-клетки гетерогенны по функциональным свойствам и уровню пролиферативной активности. Установлено, что по мере дифференцировки клетки от истинно стволовой (обладающей широким спектром возможностей к дифференцировке и пролиферации) до унипотентной (способной к дифференцировке только по одному ростку кроветворения) репопулирующая способность и потенциал пролиферации снижаются.
   В пределах пула СКК и экспрессия самого стволовоклеточного антигена CD34 варьирует в широких пределах – от яркой на истинно стволовой, полипотентной стволовой клетке до слабой на унипотентных гемопоэтических предшественниках. Однако независимо от уровней экспрессии CD34 на мембране стволовых кроветворных клеток именно суммарный пул CD34+-клеток определяет скорость восстановления кроветворения при трансплантации гемопоэтической ткани [16, 17].
   Совершенствование клеточных технологий и использование прямых флюоресцентных конъюгатов моноклональных антител (МКА) к антигену CD34 сократило срок определения количества стволовых, CD34+-клеток в любой кроветворной ткани до 1,5–2 ч. Определение стволовых клеток проводится цитофлюориметрически в реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием различных флюорохромных конъюгатов МКА к антигену CD34. При краткосрочности выполнения методика цитометрического определения СКК достаточно сложна, поскольку речь идет о минорной клеточной популяции.
   В настоящее время существует несколько стандартизированных и одинаково признанных в мире цитометрических протоколов оценки СКК [18–21].
   Двухэтапный протокол (SIHON) для определения абсолютного количества стволовых клеток требует подсчета 2 величин: процента CD34+-ядерных клеток (цитометрия) и числа лейкоцитов крови (гемограмма).
   Так называемый ISHAGE [22] дает возможность напрямую при цитометрическом определении выявлять абсолютное количество CD34+-клеток в 1 мкл исследуемой кроветворной ткани и не требует подсчета лейкоцитов. По нашему мнению [23–25], второй метод менее гибкий, несмотря на кажущуюся простоту, так как не позволяет определять число CD34+-клеток при лейкоцитах менее 1000 клеток, что бывает клинически необходимо. Протокол ISHAGE требует специальных программ обработки и достаточно дорогих реагентов.
   В начале нашей работы по изучению стволовых клеток (лаборатория иммунологии гемопоэза, отдел клинической иммунологии, НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН) мы применяли простой двухэтапный протокол с одноцветной меткой [26,27]. При этом использовались МКА к CD34-антигену, меченные фикоэритрином или флюоресцеинизотиоционатом (FITC).
   Анализируемая область, гейт (в терминологии цитофлюориметрии – это область цитограммы или гистограммы, где сосредоточены клетки с определенными параметрами), выбирался на основании характеристик прямого светорассеяния FSC (forward scatter – показатель, характеризующий размер клетки) и бокового светорассеяния SSC [side scatter – показатель, определяющий характер/количество клеточных включений, или гранулярность (рис. 1)].
   Именно на этом этапе работы установлено, что стволовую клетку можно охарактеризовать цитометрически не только на основании экспрессии специфических антигенов, но также по размеру и гранулярности, несмотря на ее морфологическую однородность. Полученные нами данные подтвердили возможность выбора области анализа (гейта) при определении стволовых клеток на основании параметров светорассеяния.
   Как видно на рис. 2, основной фракции стволовых клеток соответствует область низких значений SSC (количество включений в цитоплазму минимально), тогда как размер (достаточно равномерное распределение вдоль оси FSC) их значительно варьирует. Таким образом, по характеристикам светорассеяния стволовая клетка соответствует малому, среднему или крупному лимфоциту, что подтвердило данные, полученные ранее при изучении КОЕ стволовой клетки. Сведения могут оказаться весьма важными для дальнейшей детальной характеристики отдельных субпопуляций стволовых клеток.
   В последующем простой двухэтапный метод нами модифицирован и была использована двойная метка [24, 25]. При этом цитометрически определяется количество стволовых клеток среди CD45+-клеток, т. е. число CD34+-лейкоцитов, что значительно упрощает процедуру подсчета абсолютного количества стволовых клеток в образце.
   В ходе отработки указанной выше методики нами показано, что уровни экспрессии CD45 для основной массы CD34+ клеток являются достаточно слабыми (рис. 3).
   Изучение стволовых клеток включает несколько аспектов. В первую очередь это клиническая необходимость, поскольку успех трансплантации определяется качеством трансплантационного материала, которое напрямую зависит от числа CD34+-клеток. Изучение стволовой клетки имеет также значительный научный интерес, поскольку знание закономерностей ее поведения, связи с микроокружением поможет более глубоко понимать функционирование системы кроветворения в целом.
   В начале исследований нами установлены четкие достоверные связи между способностью к колониеобразованию и числом CD34+-клеток для образцов периферической крови и для цитаферезных продуктов [26, 27]. Таким образом, показана адекватность подсчета стволовых клеток на основании экспрессии CD34-антигена и оценки качества трансплантационного материала на основании числа CD34+-клеток.
   Подтверждение связи между числом CD34+-клеток и количеством КОЕ в трансплантируемой ткани дало возможность использовать первый показатель для подсчета адекватной трансплантационной дозы. Исследование, проведенное в нашей лаборатории, показало, что только число CD34+-клеток в материале трансплантации на 1 кг массы тела больного достоверно сокращало длительность критической лейкопении (р=0,001), тогда как достоверных различий в сроках восстановления кроветворения в зависимости от содержания КОЕ в трансплантате получено не было [23, 26].
   Анализ данных многих трансплантационных центров показал, что достаточной для восстановления кроветворения является доза в 2 ґ 10⁶ CD34+-клеток на 1 кг массы тела больного. Однако наши исследования материала трансплантации и сроков восстановления кроветворения у взрослых пациентов выявили, что достоверное сокращение длительности критической цитопении возможно только при трансплантации 3 ґ 10⁶ и более CD34+-клеток на 1 кг массы тела больного (р=0,002). При этом длительность восстановления лейкоцитов крови до 1000 клеток на 1 мкл не превышала 10 дней, а тромбоцитов до 40 000 клеток на 1 мкл можно было ожидать в течение первых 2 нед с момента аутологичной трансплантации ПСКК [23].
   Таким образом, для всех пациентов, у которых планируется проведение высокодозной химиотерапии с аутологичной трансплантацией стволовых клеток или у доноров в случае аллогенной трансплантации нами проводится подсчет CD34+-клеток в каждом продукте цитафереза с целью подсчета набранной дозы стволовых клеток, а также для решения вопроса о необходимости повторных цитаферезов.
   Даже трансплантация более 3 ґ 10⁶ CD34+-клеток не всегда приводит к успешному, полноценному, трехростковому восстановлению кроветворения. Есть данные о том, что примерно 10% случаев трансплантаций сопровождается длительными (30 дней и более) тромбоцитопениями [19]. В ряде случаев после восстановления гемопоэза отмечаются повторные отсроченные цитопении, приводящие к серьезным инфекционным осложнениям. Очевидно, что проблема посттрансплантационных осложнений все еще существует и, возможно, решить ее поможет более детальное изучение отдельных субпопуляций CD34+-клеток.
   Неоднородность пула стволовых клеток подтверждена и на основании роста различных типов клеточных колоний в системе полужидких и долгосрочных клеточных культур, и иммунологически, на основании фенотипа CD34+-клеток [26–30]. Пул CD34+-клеток включает коммитированные (лимфоидные, миелоидные, мегакариоцитарные, эритроидные), отвечающие за восстановление конкретного ростка кроветворения клетки, а также фракцию линейно не коммитированных стволовых клеток, определяющих стабильность восстановления кроветворения в течение длительного срока.
   В начале изучения стволовых клеток характеристика субпопуляций являлась чисто исследовательским, поисковым аспектом. Было показано соответствие различных типов КОЕ и иммунологического фенотипа CD34+-клеток, изучались пролиферативный потенциал и восстанавливающая способность каждой отдельно взятой фракции, с открытием новых клеточных кластеров дифференцировки детализировался и иммунофенотип стволовых клеток. Именно на основании иммунологического фенотипа CD34+-клеток показаны более детальные различия между стволовыми клетками костного мозга, периферической крови, пуповинной крови и еще раз подтверждены преимущества использования периферической крови в качестве источника стволовых клеток при трансплантации кроветворной ткани.
   Спектр изучаемых молекул, ассоциированных в той или иной степени со стволовой клеткой, достаточно широк. Так, в лаборатории иммунологии гемопоэза панель МКА, используемых при характеристике субпопуляций, включает следующие маркеры: линейно не ограниченные антигены CD45, HLA-DR, CD38, CD117, CD50, CD90, миелоидно-коммитированные антигены CD13, CD33, CD14, антигены лимфоидной направленности дифференцировки – Т-клеточные CD7, CD2, В-клеточные CD19, CD20, ранние антигены ЕК-клеток CD57, CD56, трансферриновый рецептор CD71 и common-антиген CD10.
   Изучение субпопуляционного состава стволовых клеток – очень трудоемкая процедура. В ходе выполнения исследований нами отработаны методы двойной и тройной окраски стволовых клеток, что дает возможность одновременно оценить экспрессию на стволовой клетке 2 или 3 различных антигенов.
   При анализе и сборе клеток гейт выбирается не на основании характеристик светорассеяния или экспрессии CD45, а только по уровням экспрессии CD34-антигена (рис. 4). Набор анализируемых клеточных событий осуществляется в пределах фракции CD34+-клеток. Для достоверного анализа необходим набор не менее 500 и 1000 CD34+-клеток, а это значит, что из каждой пробы должно быть проанализировано 5–10 млн мононуклеарных клеток (в зависимости от процента CD34+-клеток).
   При изучении характеристики мембранного иммунофенотипа стволовой клетки нами исследовано более 150 образцов кроветворной ткани (периферическая кровь, продукты цитаферезов) у взрослых пациентов, детей и доноров в ходе стимуляции кроветворения и сбора ПСКК для аутологичной и аллогенной трансплантации [23, 24].
   Наши исследования показали мономорфность экспрессии молекулы HLA-DR на CD34+-клетках (84,6±2,2%). Наиболее низкие уровни CD34+HLA-DR+-клеток в цитаферезном продукте указывали на момент пика стимуляции кроветворения и выхода наибольшего количества стволовых клеток в периферическое русло. Отмечено существование отрицательных корреляций между экспрессией HLA-DR и большинством линейнокоммитированных антигенов в пределах стволовых клеток, что подтверждает постепенную утрату рецептора к данной молекуле по мере созревания и дифференцировки CD34+-клеток. Только для клеток с фенотипами CD34+CD38+ и CD34+CD13+ показаны достоверно значимые корреляции в отношении экспрессии на стволовой клетке молекулы HLA-DR, что говорит о возможности существования фракции плюрипотентных (с широким спектром дифференцировки) стволовых клеток с фенотипом CD34+CD38+HLA-DR+CD13+.
   Популяция CD34+-клеток, экспрессирующих антигены CD38 и CD71, оказалась более гетерогенной по сравнению с CD34+HLA-DR+-клетками. Нами выявлены достоверные корреляции между числом стволовых клеток, экспрессирующих антиген CD71, и числом CD34+-клеток, экспрессирующих ранние лимфоидные маркеры. Данные подтверждают полипотентность популяции CD34+CD71+-клеток в отношении лимфоидного звена гемопоэза (возможность существования общего предшественника Т- и В-клеток).
   Высокие уровни экспрессии CD38 на стволовых клетках практически исключали возможность коэкспрессии Т-клеточного антигена CD7, а также молекулы CD13, вместе с тем сочетания CD34+CD38+CD33+ и CD34+CD38+CD71+ были весьма вероятны (р=0,010).
   Наш опыт изучения экспрессии миелоидных антигенов выявил низкую вероятность существования на определенных этапах дифференцировки “здоровой” стволовой клетки, экспрессирующей одновременно рецепторы к антигенам CD13 и CD33 (R=-0,787; p=0,004).
   Экспрессия изученных лимфоидных антигенов в большинстве случаев была минимальной и редко превышала 5%. Однако в ряде изученных образцов цитоконцентратов у взрослых пациентов нами выявлена значительная пропорция стволовых клеток (до 50%) со слабой экспрессией Т-клеточного антигена CD7. Ряд образцов цитоконцентратов (дети) имел значительные (до 60%) пропорции клеток с фенотипом CD34+CD19+.
   Экспрессия молекулы клеточной адгезии CD50 на CD34+-клетках была мономорфной во всех изученных нами случаях. Достаточно значительной была пропорция CD34+-клеток, экспрессирующих c-kit-рецептор CD117 (63,6–93,0%).
   Также мономорфной и достаточно слабой (см. рис. 3) была экспрессия на стволовых клетках панлейкоцитарного антигена CD45.
   Таким образом, впервые с использованием широкой панели антител нами подтверждена значительная гетерогенность пула стволовых гемопоэтических клеток и показано преобладание в трансплантируемом материале фракции полипотентных стволовых клеток с фенотипом CD34+CD45+ (low)CD38+ HLA-DR+ CD71+.
   Представленные данные имеют скорее научный, нежели практический интерес, помогают детально представить последовательность событий при дифференцировке гемопоэтической клетки на ранних этапах.
   Однако проблема изучения субпопуляций из чисто научной сферы переходит сейчас в разряд клинически значимых. Накоплен значительный материал, демонстрирующий влияние отдельных субпопуляций стволовых клеток на скорость восстановления ростков кроветворения. Как отмечено выше, наиболее длительно восстанавливается количество тромбоцитов, именно поэтому значительное внимание во всем мире уделяется фракции CD34+CD61+, т. е. мегакариоцитарным предшественникам. Целый ряд исследований продемонстрировал существование достоверных корреляций между количеством клеток указанного типа и скоростью восстановления тромбоцитов [31, 32]. Значительный интерес представляют наблюдения о связи данной популяции со скоростью восстановления нейтрофилов крови в ходе трансплантации кроветворной ткани.
   Показано, что достоверно более короткие сроки восстановления тромбоцитов и нейтрофилов обусловлены наличием в трансплантируемом материале субпопуляций с фенотипом CD34+L-selectin+, CD34+CD44+, CD34+CD41+. Важным для сокращения критической тромбоцитопении оказалось присутствие в трансплантируемой ткани клеток с фенотипом CD34+ GPIIb+/GPIIIb+, CD34+GlyА+, CD34+CD41a+. Подтверждена важность субпопуляций стволовых клеток, экспрессирующих рецепторы FLt-3 и G-CSF, для восстановления нейтрофильного и гранулоцитарного ростков кроветворения [33, 34]. Особое внимание уделяется фракции линейно не коммитированных стволовых клеток, фенотип которых может быть охарактеризован как CD34+CD38-CD33-. Подтверждено, что длительность тромбоцитопении находится в обратной зависимости от числа данных клеток. Таким образом, при значительном преобладании в материале трансплантации фракции истинно стволовых клеток (что в условиях стимуляции ростовыми факторами достаточно редко) возникает риск задержки восстановления кроветворения [35, 36].
   Дальнейшие исследования субпопуляций стволовых клеток были направлены на изучение антигенов, ассоциированных с истинно стволовой, линейно не коммитированной клеткой. Иммунофенотипически фракция наиболее ранних стволовых клеток характеризуется яркой экспрессией общего антигена стволовых клеток – молекулы CD34, слабой экспрессией панлейкоцитарного антигена CD45, экспрессией антигена Thy-1 (CD90), отсутствием экспрессии молекул HLA-DR и CD38, а также отсутствием на мембране клеток линейно ограниченных антигенов [37–39].

Рис. 1. Подсчет количества стволовых клеток в образце цитоконцентрата простым двухэтапным методом (цитометрия).

Цитограмма А – выбор анализируемой области R1 (гейта) на основании параметров светорассеяния. По оси Х – FSC, по оси Y – параметр SSC. Гейт включает всю область FSC, тогда как значения SSC выбраны минимальными (low).
Цитограмма B – количество стволовых клеток в данном цитоконцентрате. По оси Х – уровни экспрессии CD34-антигена, по оси Y – параметр SSC. Область R2 – CD34+-клетки, составляют 4,01% в пределах гейта R1, составляющего в свою очередь 58,8% от всей клеточной популяции.
Цитограмма С – изотипический контроль для оценки уровней неспецифического связывания в данном образце. По оси Х – уровень экспрессии IgG1 (0,0%).
Таким образом, уровень стволовых клеток в данном цитоконцентрате в пересчете на всю клеточную популяцию составил: 4,01Ґ0,59 = 2,34%.


Рис. 2. Область светорассеяния стволовых клеток (цитометрия).

Цитограмма А – гейт CD34+-клеток (R1). По оси Х – уровни экспрессии CD34-антигена, по оси Y – распределение относительно характера клеточных включений.
Цитограмма В отражает область стволовых клеток в параметрах светорассеяния. На цитограмме отражены только клетки, попавшие в гейт R1, т. е. CD34+-клетки. По оси Х – параметр FSC (чем правее расположено клеточное событие, тем больше размер данной клетки). По оси Y – параметр SSC (чем выше расположено клеточное событие, тем разнообразнее характер клеточных включений).

Рис. 3. Экспрессия CD45-антигена в популяции стволовых CD34+-клеток.

Цитограмма А – уровни экспрессии CD45 для основных клеточных популяций. По оси Х – экспрессия CD45-антигена, по оси Y – SSC. Лимфоциты и моноциты характеризует яркая экспрессия антигена – это популяции клеток, расположенных правее (около значений 103) по оси Х. Гранулоциты характеризуют слабая экспрессия общелейкоцитарного антигена и высокие уровни SSC.
Цитограмма В – гейт CD34+-клеток (R1).
Цитограмма С – распределение CD34+-клеток в параметрах SSC vs CD45. Представлены только клетки, попавшие в гейт R1, т.е. CD34+- клетки, основная их масса расположена значительно левее значений 103. Таким образом, уровни экспрессии общелейкоцитарного антигена на большинстве стволовых клеток достаточно низкие (CD45 low).


Рис. 4. Выбор анализируемого гейта при характеристике субпопуляций стволовых клеток (цитометрия).

Цитограмма А – изотипический контроль, определяющий уровни неспецифического связывания. По оси Х – экспрессия IgG1, по оси Y – гранулярность клеток.
Цитограмма В отражает правильность выбора гейта для сбора CD34+- клеток. По оси Х – уровни экспрессии CD34-антигена, по оси Y – гранулярность клеток. Все CD34+-клетки включены в гейт R1.
Цитограмма С – окончательный образец сбора стволовых клеток. Параметры аналогичны таковым цитограммы В, но набор клеточных событий осуществлен в гейте R1, включающем стволовые клетки (гейт R2) и незначительную примесь гранулоцитов (фон). Дальнейший анализ субпопуляций выполняется только в гейте R2, т. е. среди CD34+- клеток.


   Именно количество стволовых CD34+-клеток, экспрессирующих Thy-1-антиген в материале трансплантации, связывают с длительным и устойчивым восстановлением кроветворения [30, 40]. Интересно, что пик мобилизации CD34+CD90+-клеток проявляется в крови раньше, чем пик мобилизации суммарного количества CD34+-клеток [39].
   Стволовые гемопоэтические клетки, составляющие фракцию Thy-1-позитивных клеток, способны поддерживать рост долгосрочных культур костного мозга. Эта фракция включает клетки, формирующие так называемую область булыжника, и клетки, репопулирующие кроветворные органы при трансплантации у SCID-hu мышей [41, 42].
   Таким образом, наиболее легко выявляемая характеристика ранних стволовых кроветворных клеток (по сравнению с выявлением CD34+ HLA-DR-CD38-фракции) – это экспрессия молекулы CD90. Популяция Thy-1+-стволовых клеток не является однородной, и сведения по иммунофенотипу этих клеток достаточно противоречивы.
   В наших исследованиях средний процент CD90+CD34+-клеток составила 18,5±3,3%, что в целом соотносится с данными зарубежных исследований. Однако уровни CD90+-клеток в пределах CD34+-фракции варьировали в достаточно широких пределах (0,1–70,6%).
   В отношении характера экспрессии Thy-1+ на стволовых клетках можно сказать, что большинство CD34+ клеток в нашем исследовании экспрессируют молекулу CD90 довольно слабо, и только в редких ситуациях это бывает отчетливая, отдельная фракция антигенопозитивных клеток. Следует сказать, что случаи высокого содержания Thy-1+-стволовых клеток в цитаферезном продукте – не частая ситуация. По данным зарубежных исследований, средний процент стволовых клеток крови, экспрессирующих Thy-1-антиген не превышает 10%, что значительно ниже их количества в костном мозге, пуповинной крови и зародышевых тканях [41, 43]. В нашем исследовании также лишь в 8 из 35 случаев содержание CD34+CD90+-клеток превысило 30% от общего числа СКК, и только в 4 случаях количество CD34+CD90+-клеток было более 50% среди всех клеток пула стволовых кроветворных. Это можно объяснить, во-первых, особенностью применяемых мобилизационных протоколов. Кроме того, возможна разница во времени стимуляции общего количества стволовых CD34+-клеток и фракции ранних стволовых клеток с фенотипом CD34+CD90+ [44, 45].
   По характеристикам светорассеяния Thy-1+ стволовые кроветворные клетки, как и большинство CD34+ клеток, представляли достаточно гомогенную по размерам популяцию и имели низкие показатели SSC. Показатель FSC для Thy-1-позитивных стволовых клеток был более низким по сравнению со всеми клетками пула CD34+.
   Интенсивность экспрессии CD34-антигена в пределах субпопуляции CD90+-стволовых клеток несколько ниже, чем для суммарного пула CD34+-клеток.
   При сопоставлении экспрессии Thy-1-антигена и экспрессии целого ряда дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека на стволовых кроветворных CD34+-клетках нами получены следующие данные. Не выявлено достоверных значимых корреляций для антигенов CD38 и HLA-DR. Вместе с тем в ряде случаев мы наблюдали присутствие одновременно выраженного количества Thy-1+- и HLA-DR+-стволовых (CD34+) клеток в кроветворной ткани, как и присутствие выраженной фракции стволовых CD34+-кроветворных клеток, одновременно экспрессирующих антиген Thy-1 и молекулу CD38.
   Все сказанное выше подтверждает большую гетерогенность иммунологического фенотипа CD34+CD90+-клеток, а также возможность присутствия популяций CD34+HLA-DR- и CD34+CD38- в пределах фракции Thy-1+-стволовых клеток.
   Вопреки данным литературы [46, 47] значимых корреляций в отношении экспрессии на стволовых клетках с-kit-рецептора (CD117) и Thy-1-антигена (p=0,7, n=6) нами не получено. Вместе с тем средние уровни CD117+CD34+-стволовых клеток составили 82,1±4,1% и, как и в случае с HLA-DR и CD38, в 2 образцах из 6 (где оценивались и CD117 и CD90) содержание Thy-1+-стволовых клеток было больше 50%. Дальнейшие исследования позволят более точно оценить частоту встречаемости субпопуляции CD117+CD90+ среди мобилизованных СКК и подтвердить факт коэкспрессии обеих молекул в пределах одной стволовой кроветворной клетки.
   Достоверные значимые корреляции установлены в отношении экспрессии Thy-1 и одного из панмиелоидных антигенов, молекулы CD33 (р=0,037, n=33) на стволовых CD34+-кроветворных клетках.
   Нами установлен также факт корреляции между субпопуляцией CD34+-клеток, экспрессирующих Thy-1-антиген, и CD34+CD19+-клетками среди мобилизованных стволовых кроветворных клеток (р=0,029, n=20). Возможность коэкспрессии В-клеточного антигена CD19 и Thy-1-антигена описана ранее [48]. Однако для подтверждения факта сосуществования двух данных антигенов на уровне одной кроветворной клетки необходимы дополнительные углубленные исследования.
   Получены также высокодостоверные корреляции, подтверждающие возможность одновременного присутствия в трансплантированной ткани CD34+-клеток, экспрессирующих как Thy-1-антиген, так и трансферриновый рецептор, молекулу CD71 (p=0,009, n=30). При использовании трехцветного флюоресцентного анализа у 2 пациентов мы подтвердили коэкспрессию Thy-1-антигена и трансферринового рецептора на одной CD34+-клетке.
   Изучение влияния отдельных субпопуляций на восстановление кроветворения с наибольшей достоверностью возможно при трансплантации материала от одного цитафереза. Только в этом случае возможен подсчет точной дозы каждой из трансплантированных субпопуляций стволовой клетки. В настоящее время мы проводим детальный анализ влияния изученных субпопуляций стволовых клеток на восстановление кроветворения после высокодозной химиотерапии у детей (результаты не представлены).
   Несомненный научный интерес представляет поиск новых маркеров стволовой клетки. Одной из подобных молекул, изучаемых нами, являлась молекула АС133, кластированная в дальнейшем как CD133. Данный антиген рассматривался мировым научным сообществом как возможная альтернатива CD34-антигену. В рамках участия в 7-м Международном совещании по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека (the 7 Workshop and Conference on HLDA-7, Harrowgaite, England, 2000) мы изучили экспрессию АС133 и CD34 в сочетании с иммунофенотипом стволовых клеток. Установлено, что медиана экспрессии АС133 в гейте CD34+-клеток составляет 75,8% (44,9–95,2%). Существенным явилось отсутствие фракции АС133+-клеток, отрицательных по CD34-антигену [49]. Таким образом, широта спектра экспрессии данной молекуулы не перекрывает CD34, следовательно, данный антиген не может заменить CD34. Наличие корреляций с миелоидно-коммитированными стволовыми клетками показывает принадлежность популяции CD34+CD133+ к фракции ранних миелоидно-коммитированных клеток-предшественниц.
   Несмотря на значительные успехи трансплантологии, в клинической практике остаются ситуации, когда набрать необходимое количество качественного материала для трансплантации не представляется возможным. Поэтому весьма перспективным представляется изучение рецепторов ранних цитокинов и ростовых факторов стволовой клетки, открывающее возможность поиска новых стимулирующих факторов. В ходе подобных исследований возникают предпосылки для возможного размножения стволовых клеток в условиях in vitro с целью получения достаточного количества качественного трансплантационного материала.
   Наиболее интересным объектом изучения в данном аспекте представляется рецепторный комплекс ИЛ-6 и особенно его b-цепь – молекула gp 130, которая является трансдуцерной молекулой всего семейства цитокинов ИЛ-6. Именно димеризация gp 130 под влиянием естественного цитокина, его растворимого рецептора или МКА к активным эпитопам самой gp 130 запускает каскад внутриклеточных реакций, приводящих к пролиферации и дифференцировке клеток. Изучением данной молекулы и рецепторного комплекса ИЛ-6/ИЛ-6Р наша лаборатория занимается более 5 лет в рамках совместной работы с лабораторией UNIT INSERM 478, Montpellier, France [50–53].
   Нами изучена экспрессия основных эпитопов рецепторного комплекса ИЛ-6/ИЛ-6Р на стволовых гемопоэтических клетках и прослежена возможная связь с иммунологическим фенотипом CD34+-клеток.
   В реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием прямых конъюгатов МКА, методом двойной или тройной метки изучена экспрессия основных эпитопов gp 130 (A1, B1, D1 и группы С) и эпитопа gp 80 (a-цепь рецепторного комплекса) – М91. Прямые конъюгаты МКА к эпитопам gp 130 и gp 80 для нашего исследования любезно предоставлены J. Brochier (UNIT INSERM 478, Montpellier, France). В ходе работы показано, что все CD34+-клетки были gp 130+, т. е. выявлялась экспрессия двух эпитопов молекулы и более. Экспрессия gp 80 выявлялась не более чем на 30% CD34+-клеток образца, имелись и отрицательные случаи. В большинстве (19 из 27) изученных случаев CD34+-клетки экспрессировали все эпитопы gp 130. Процент CD34+A1+ и CD34+ C+ был приблизительно одинаковым. Экспрессия В1 на стволовых клетках была мономорфной во всех изученных случаях. Сравнительный анализ субпопуляций CD34+-клеток, несущих активированную форму молекулы gp 130 (A1-, C+, D1+) и неактивированную форму (все эпитопы +) показал, что при экспрессии gp 130 в активированной форме среди CD34+-клеток преобладает популяция ранних стволовых клеток, экспрессирующих молекулу CD90, в сравнении с ПСГК, экспрессирующими неактивную форму молекулы gp 130 [54]. Исследования возможной связи gp 130 и всего рецепторного комплекса ИЛ-6 в целом с различными субпопуляциями стволовой клетки нами продолжаются.
   В целом, несмотря на широту мировых исследований по изучению столовой клетки, остается много нерешенных вопросов. Так, например, четко не решен вопрос о фенотипе истинно столовой (наиболее ранней) кроветворной клетки. Кроме того, не совсем понятна роль каждой конкретной субпопуляции в восстановлении гемопоза. Очень сложным является вопрос о роли субпопуляций столовых клеток в восстановлении полноценности иммунологической системы (динамика восстановления Т- и В-клеточного звена) при аллогенной трансплантации кроветворной ткани, а так же их связь с развитием реакций "трансплантат против хозяина" и "трансплантат против болезни".
   Таким образом, углубленное изучение субполпуляционного состава пула СКК является важным как с точки зрения фундаментальных проблем кроветворения, так и с клинической точки зрения.   

/media/onkology/06_01/43.shtml :: Wednesday, 14-Jun-2006 22:11:24 MSD

© Издательство Media Medica, 2000. Почта :: редакция, webmaster